Bilirubin-Oxidase

Bilirubin ist eine Klasse von linearen Tetrapyrrol-Derivaten und eines der Metaboliten von Eisenporphyrinverbindungen im menschlichen Körper. Wenn die Bilirubinproduktion übermäßig ist oder die Bilirupinaufnahme, -kombination und -ausscheidung der Leberzellen gestört ist, steigt die Bilirubinkonzentration im Blut und führt zu Hyperbilirubinämie. Daher ist die klinische Bestimmung von Bilirubin wichtig für die Erkennung von hepatobiliären Erkrankungen, Hämolyse und anderen verwandten Krankheiten. Bilirubinoxidase ist ein häufig verwendetes Werkzeugenzym, das die Oxidation von Bilirubin katalysiert, um Biliverdin zu produzieren, das in der klinischen Diagnostik zur Bestimmung der Serum-Bilirubin- und Gesamtbilirubinwerte verwendet wird. Es ist empfindlicher zur Überwachung von Lebererkrankungen als unspezifische chemische Methoden, und Serum-Bilirubin-Studien liefern detailliertere Informationen über die Pathologie von Gelbsucht.

Struktur

Holoenzym der Bilirubinoxidase besteht aus Proteinen, zweiwertigen Kupferionen und Kohlenhydraten. Das Protein besteht aus 17 Aminosäuren ohne Cystein, niedrigen Gehalten an Lysin und Methionin sowie hohen Gehalten an Asparaginsäure, Glutaminsäure und Alanin. Der Vorläufer der Bilirubinoxidase besteht aus 572 Aminosäureresten, einschließlich 534 Aminosäuren und 38 Aminosäurenführern. Die 19 hydrophoben Aminosäuren am C-terminalen Ende des Führers sind in ihrer Beschaffenheit bekannten Signalpeptiden ähnlich und könnten ebenfalls eine Rolle als Signalpeptide spielen. Spektralanalysen haben gezeigt, dass zweiwertige Kupferionen an Cys-, Met- und His-Reste binden können. Die Gensequenz der Bilirubinoxidase ist in 6 Exons durch 5 Introns unterteilt. Alle Intron-Grenzen sind mit doppelsträngigen Nukleotiden mit GT und AG gekennzeichnet. Vier Transkriptionsstartstellen wurden durch Primerverlängerungsanalysen gefunden, und die Haupttranskriptionsstartstelle lag 93 Basen stromaufwärts des ATG-Startcodons.

Eigenschaften

Der isoelektrische Punkt der Bilirubinoxidase liegt bei etwa 4,1. Die Michaelis-Konstante des Enzyms ist aufgrund unterschiedlicher Stämme leicht unterschiedlich. In der Regel ist die Natur der Bilirubinoxidase bei 37 °C und einem pH-Wert zwischen 5,0 und 9,7 stabil, und am stabilsten bei 5 °C und einem pH-Wert von 9,2 bis 9,7. Die optimale Reaktionstemperatur der Bilirubinoxidase liegt bei etwa 40 °C, der optimale Reaktions-pH liegt bei etwa 8, und das Enzym ist im sauren Bereich nicht leicht löslich. Das berichtete Molekulargewicht der Bilirubinoxidase beträgt 52 kDa und 68 kDa, der Unterschied zwischen den beiden Molekulargewichten könnte auf das Vorhandensein einer natürlichen Bilirubinoxidase-Oligosaccharidkette zurückzuführen sein. Das Molekulargewicht der Bilirubinoxidase in Penicillium janthinellum beträgt 2000 kDa, was auf die Metallionen zurückzuführen ist, die das Enzymprotein vernetzen. Die Bilirubinoxidase verliert ihre Aktivität, wenn sie Ascorbat und Kaliumcyanid verwendet, um zweiwertige Kupferionen zu entfernen. Apo-abgeleitete Bilirubinoxidase gewinnt die Aktivität in unterschiedlichem Maße zurück, wenn sie mit Kobalt-, Cadmium- und Eisenionen ergänzt wird. Dies zeigt, dass die katalytische Leistung der Bilirubinoxidase eng mit Metallionen verbunden ist. Quecksilberionen können die Enzymaktivität signifikant steigern, da Quecksilberion und Substrat kombinieren, um geeignetere enzymkatalysierte Zwischenprodukte zu bilden. Kaliumcyanid, Natriumazid und Thiourea können die Reaktion hemmen. Bilirubinoxidase reagiert spezifisch mit tetrapyrrolhaltigen Verbindungen und kann auch einige Laccase-Substrate oxidieren.

Katalytischer Mechanismus

Bilirubinoxidase ist eine kupferhaltige Polyphenoloxidase, die drei Arten von Kupferionen enthält. Ein Typ I Kupferion vermittelt den Elektronentransfer vom Substrat zu anderen Kupferstellen. Sauerstoffmoleküle sind an ein trinukleares Zentrum mit einem Typ II Kupferion und zwei Typ III Kupferionen gebunden, die zu zwei Wassermolekülen reduziert werden. Daher ist der katalytische Prozess eine Oxidationsreaktion, die molekularen Sauerstoff als Elektronenakzeptor nutzt. Detektiert durch Elektronenabsorptionsspektroskopie und Dünnschichtchromatographie ist die spezifische Reaktion: Bilirubin + 1/2 O₂ → Biliverdin + H₂O. Der Prozess besteht darin, dass Bilirubinoxidase Bilirubin katalysiert, um Bilirubin zu erzeugen, das weiter oxidiert wird, um eine Art farbloses Material zu bilden. Studien haben gezeigt, dass der katalytische Mechanismus der Bilirubinoxidase eine sekundäre Reaktion mit dem an das Protein gebundenen Kupferion ist. Die Donorstruktur ist vom Typ CuSS*N2 (S = Cys, S* = Met, N = His), die der Ceruloplasmin-Familie entspricht. In der Bilirubinoxidase-Reaktion gegen Gelbsuchtblut wurde die Bilirubinkonzentration im Blut mittels HPLC gemessen, und es wurde festgestellt, dass die Bilirubinoxidase sowohl gebundenes Bilirubin als auch nicht konjugiertes Bilirubin oxidieren kann. Bilirubinoxidasen können gebundenes Bilirubin in Anwesenheit von Reagenzien wie Natriumchlorid selektiv oxidieren.

Klinische Anwendung

Verschiedene Lebererkrankungen können zu einem Stoffwechselstörung von Bilirubin führen. Ein Anstieg des Bilirubins führt zum Auftreten von Gelbsucht. Daher ist die Bestimmung von Bilirubin ein wichtiger Indikator für die Leberfunktion. Bilirubinoxidase kann Bilirubin katalysieren, um Bilirubin zu produzieren. Der Wechsel des Absorptionswerts bei 440 nm und 450 nm wurde gemessen, um den Gehalt an Bilirubin im Serum zu bestimmen. Daher kann Bilirubinoxidase für die klinische Diagnose von Gelbsuchtkrankheiten verwendet werden und wird voraussichtlich zur Behandlung von Neugeborenengelbsucht und Hyperbilirubinämie eingesetzt.