Das Aufkommen mRNA-basierter Impfstoffe und Therapeutika hat die moderne Medizin revolutioniert, wie die rasche Entwicklung der COVID-19-Impfstoffe eindrucksvoll gezeigt hat. Im Gegensatz zu klassischen Biologika bietet mRNA eine flexible und schnell skalierbare Produktionsplattform, die praktisch jedes gewünschte Protein kodieren kann. Die Herstellung hochwertiger mRNA erfordert jedoch eine strikte Kontrolle jedes einzelnen Schritts der Produktionskette, um Wirksamkeit, Stabilität und Sicherheit sicherzustellen.

Bei Creative Enzymes bieten wir verschiedene Enzyme für die mRNA-Produktion an, darunter T7-RNA-Polymerase, RNase-Inhibitor, DNase I, Vaccinia-Capping-Enzym und weitere. Im Folgenden stellen wir den mRNA-Produktionsprozess systematisch vor und heben kritische Parameter hervor, die Ausbeute, Reinheit und Funktionalität beeinflussen.

Abbildung 1. Prozess der In-vitro-Transkription von mRNA aus einer linearisierten DNA-Plasmidvorlage. (Knezevic et al., 2021)

Vorbereitung der DNA-Vorlage

Eine effiziente In-vitro-Transkription (IVT) zur Herstellung synthetischer mRNA beginnt mit der sorgfältigen Vorbereitung einer DNA-Vorlage, meist in Form eines konstruierten Plasmids. Diese Vorlage dient als Blaupause für die Transkription und beeinflusst unmittelbar die Genauigkeit, Stabilität und Translationseffizienz des resultierenden mRNA-Produkts.

Plasmiddesign und -konstruktion

Das als DNA-Vorlage verwendete Plasmid ist ein synthetisches Konstrukt, das eine optimale Transkription und nachgelagerte Translation sicherstellen soll. Ein typisches mRNA-kodierendes Plasmid umfasst die folgenden Kernelemente:

• Promotorsequenz: Bindestelle für eine DNA-abhängige RNA-Polymerase, typischerweise abgeleitet von Bakteriophagen wie T7, SP6 oder T3. Der Promotor ermöglicht eine hochergiebige In-vitro-Transkription und ist häufig unmittelbar stromaufwärts der 5'-untranslatierten Region (UTR) positioniert.
• 5'-Untranslatierte Region (5'-UTR): Für eine optimale Ribosomenrekrutierung konstruiert; die 5'-UTR erhöht die Translationseffizienz. Wichtige Merkmale sind Kozak-Konsensussequenzen und eine minimale Sekundärstruktur zur Erleichterung des Ribosomen-Scannings.
• Offener Leserahmen (ORF): Kodierende Sequenz für das Zielprotein. Eine an die Translationsmaschinerie des Zielwirtes angepasste Codon-Optimierung wird eingesetzt, um die Translationseffizienz zu steigern und potenzielle Immunogenität zu reduzieren.
• 3'-Untranslatierte Region (3'-UTR): Enthält Sequenzelemente zur Regulation der mRNA-Stabilität und der translationalen Kontrolle. Häufig verwendete Stabilitätsmotive stammen z. B. aus humanen β-Globin- oder α-Globin-Genen.
• Polyadenylierungssignal und Poly(A)-Schwanz: Entweder im Plasmid kodiert oder posttranskriptionell hinzugefügt; ein Abschnitt von 70–120 Adenosinresten am 3'-Ende erhöht mRNA-Stabilität und Translationseffizienz, indem er natürliche eukaryotische Transkripte nachahmt.

Zentrale Designaspekte:

• Codon-Optimierung: Ersetzung seltener Codons durch synonyme, im Ziel-Expressionssystem bevorzugte Codons verbessert die Translation, ohne die Aminosäuresequenz zu verändern.
• Vermeidung immunogener Motive: Unmethylierte CpG-Inseln, Poly(U)-Sequenzen oder andere pathogenassoziierte molekulare Muster (PAMPs) können angeborene Immunantworten auslösen. Diese Sequenzen werden im Rahmen des Sequenz-Engineerings minimiert oder eliminiert.

Plasmidvermehrung und -reinigung

Nach dem Design muss das konstruierte Plasmid für den Einsatz in Transkriptionsreaktionen im Maßstab vermehrt und gereinigt werden.

• Bakterielle Amplifikation: Das Plasmid wird mittels Transformation in einen High-Copy-Stamm von Escherichia coli (z. B. DH5α) eingebracht. Kulturen werden in Anwesenheit selektiver Antibiotika (Ampicillin, Kanamycin etc.) kultiviert, um den Plasmiderhalt sicherzustellen.
• Plasmidreinigung: Bakterienkulturen werden geerntet, und Plasmide werden mittels alkalischer Lyse extrahiert, gefolgt von Reinigungsschritten. Kommerzielle Kits auf Silika-Säulenbasis sind weit verbreitet. Für Anwendungen mit ultrareiner DNA (z. B. therapeutische mRNA) kann eine CsCl-Gradienten-Ultrazentrifugation eingesetzt werden.

Qualitätskontrollmaßnahmen:

• Agarose-Gelelektrophorese: Bestätigt die Integrität des Plasmids und das Überwiegen der supercoiled-Form, die transkriptionell am kompetentesten ist.
• Spektrophotometrie (A260/A280- und A260/A230-Verhältnisse): Bestimmt DNA-Konzentration und -Reinheit. Akzeptable Reinheitsverhältnisse liegen typischerweise bei ~1,8 für A260/A280 und >2,0 für A260/A230.

Linearisierung der Plasmid-DNA

Plasmid-DNA muss vor der IVT linearisiert werden, um Readthrough-Transkription zu verhindern und uniforme mRNA-Transkripte zu erhalten.

• Restriktionsenzymverdau: Eine eindeutige Restriktionsschnittstelle stromabwärts des Poly(A)-Schwanzes wird mit Enzymen wie BspQI, ApaI oder NotI geschnitten. Die Enzymwahl hängt vom Plasmiddesign und der gewünschten Endkonfiguration ab.
• Endcharakteristika: Zur Vermeidung unerwünschter Transkriptionsartefakte werden Enzyme bevorzugt, die stumpfe Enden oder 5'-Überhänge erzeugen, gegenüber solchen mit 3'-Überhängen.
• Reinigung der Vorlage: Nach dem Verdau werden Enzyme und kleine Fragmente durch Phenol-Chloroform-Extraktion mit anschließender Ethanolfällung oder säulenbasierte Reinigung (z. B. Silika-Spin-Säulen) entfernt. Die finale Vorlage sollte hochrein, RNase-frei und frei von unverdautem Plasmid sein.

In-vitro-Transkription (IVT)

Der IVT-Prozess synthetisiert mRNA in vitro durch Kopieren einer linearen DNA-Vorlage mittels phagenabgeleiteter RNA-Polymerasen. Eine hochergiebige und hochfidele mRNA-Synthese ist entscheidend für Anwendungen von funktioneller Proteinexpression bis zur Herstellung therapeutischer RNA.

Reaktionskomponenten

Eine Standard-IVT-Reaktion umfasst:

• RNA-Polymerase: T7-, SP6- oder T3-RNA-Polymerasen werden entsprechend dem Promotor in der Vorlage eingesetzt. T7-Polymerase ist aufgrund ihrer hohen Transkriptionseffizienz am gebräuchlichsten.
• Nukleotidtriphosphate (NTPs): Äquimolare Konzentrationen von ATP, GTP, CTP und UTP, typischerweise im Bereich von 4–8 mM, liefern die Bausteine für die RNA-Synthese.
• Reaktionspuffer: Enthält essenzielle Kofaktoren wie Magnesiumionen (Mg²⁺), Dithiothreitol (DTT) zur Aufrechterhaltung des Redoxgleichgewichts sowie Spermidin zur Stabilisierung von Nukleinsäuren.
• RNase-Inhibitoren: RNase-Inhibitoren werden zugesetzt, um die neu synthetisierte RNA während der Transkription vor Abbau zu schützen.

Abbildung 2. Saccharomyces cerevisiae RNAP II CTD. (Pal, 2020)

Optimierung der IVT-Bedingungen

• NTP-Konzentration: Zu hohe NTP-Konzentrationen können zu vorzeitigem Abbruch oder verkürzten Transkripten führen, während zu niedrige Konzentrationen die Ausbeute begrenzen. Eine ausgewogene Konzentration (~4–8 mM) ist optimal.
• Magnesiumionenkonzentration: Mg²⁺ ist entscheidend für Polymeraseaktivität und -fidelität. Optimale Konzentrationen liegen zwischen 20–30 mM und können je nach Vorlage und Maßstab eine Titration erfordern.
• Inkubationsparameter: Standard-IVT-Reaktionen werden bei 37°C für 2–4 Stunden durchgeführt. Längere Inkubation kann die Ausbeute erhöhen, steigert jedoch auch das Risiko von RNA-Abbau oder der Bildung von Verunreinigungen.

Kotranskriptionelle Modifikationen

Zur Verbesserung der Translationsleistung und zur Reduktion der Immunogenität synthetischer mRNA können mehrere Modifikationen direkt während der Transkription eingebracht werden.

5'-Capping-Strategien:

• Cap 0 (m⁷GpppG): Die einfachste Form der eukaryotischen mRNA-Kappe. Wird häufig in molarem Überschuss zu GTP zugesetzt, um eine effiziente Inkorporation sicherzustellen.
• ARCA (Anti-Reverse Cap Analog): Verhindert die Inkorporation in umgekehrter Orientierung und stellt die korrekte 5'-End-Orientierung sicher, wodurch die Ribosomenerkennung verbessert wird.

Nukleotidmodifikationen:

• Pseudouridin (Ψ) und N1-Methylpseudouridin (m¹Ψ): Diese Analoga reduzieren die Erkennung durch das angeborene Immunsystem (z. B. über TLR7/8) und erhöhen die Translationseffizienz.
• 5-Methylcytidin (m⁵C): Verbessert die mRNA-Stabilität durch erhöhte Resistenz gegenüber Nukleaseabbau und trägt zur Optimierung der Translation bei.
• Weitere Modifikationen (z. B. 2-Thiouridin, N6-Methyladenosin) werden für das Engineering therapeutischer mRNA untersucht, um Pharmakokinetik zu verbessern und inflammatorische Signalwege zu reduzieren.

Posttranskriptionelle Prozessierung

Nach der In-vitro-Transkription (IVT) muss die resultierende RNA eine Reihe posttranskriptioneller Modifikationen und Reinigungsschritte durchlaufen, um eine reife, stabile und translationskompetente Messenger-RNA (mRNA) zu erhalten. Diese Prozesse stellen sicher, dass das synthetische Transkript natürliche eukaryotische mRNA sowohl strukturell als auch funktionell nachbildet und damit die Wirksamkeit in nachgelagerten Anwendungen wie Proteinexpression und mRNA-basierten Therapeutika maximiert.

Enzymatisches Capping (falls nicht kotranskriptionell durchgeführt)

Während kotranskriptionelle Capping-Strategien bzw. der Einsatz von Anti-Reverse Cap Analogs (ARCAs) zunehmend bevorzugt werden, bleibt das enzymatische Capping eine robuste Alternative, insbesondere für mRNA in Forschungsqualität und therapeutischer Qualität, wenn eine präzise Kontrolle von Capping-Effizienz und -Fidelität erforderlich ist.

• Vaccinia-Capping-Enzym (VCE): Dieser multifunktionale Enzymkomplex katalysiert die sequenzielle enzymatische Addition einer 5'-Cap-Struktur, bekannt als Cap 0 (m⁷GpppN), wobei „m⁷G“ ein 7-Methylguanosin bezeichnet, das über eine 5'–5'-Triphosphatbrücke mit dem zuerst transkribierten Nukleotid verknüpft ist. Die VCE-Aktivität umfasst RNA-Triphosphatase-, Guanylyltransferase- und (Guanin-N7)-Methyltransferase-Funktionen. Die Cap-Struktur ist entscheidend für Transkriptstabilität, effiziente Translationsinitiation und Resistenz gegenüber exonukleolytischem Abbau.
• 2'-O-Methyltransferase: Konvertiert Cap 0 zu Cap 1 (m⁷GpppNm) durch Methylierung der 2'-Hydroxylgruppe der Ribose des zuerst transkribierten Nukleotids. Cap-1-Strukturen werden vom Wirtsimmunsystem als „self“ erkannt und reduzieren dadurch signifikant angeborene Immunantworten, die über Toll-like-Rezeptoren (TLRs), RIG-I und MDA5 vermittelt werden.

Das enzymatische Capping ermöglicht eine nahezu quantitative Umwandlung uncappter RNA in die vollständig gecappte Cap-1-Struktur und ist besonders für sensitive Anwendungen wie Impfstoffentwicklung und Genersatztherapien geeignet.

Abbildung 3. Sequenzielle enzymatische Aktivitäten zur Bildung der RNA-5'-Endkappe. (Pal, 2020)

Poly(A)-Tailing

Wenn im Plasmid-DNA-Konstrukt kein Polyadenylierungsabschnitt kodiert ist, muss der 3'-Poly(A)-Schwanz posttranskriptionell enzymatisch hinzugefügt werden.

• Poly(A)-Polymerase (PAP): Katalysiert die vorlagenunabhängige Addition von Adenosinmonophosphaten an das 3'-Hydroxylende des RNA-Transkripts. Diese enzymatische Reaktion nutzt typischerweise ATP als Substrat und wird in optimierten Puffersystemen durchgeführt, um Homogenität und eine geeignete Schwanzlänge sicherzustellen.
• Optimale Poly(A)-Schwanzlänge: Empirische Studien legen nahe, dass ein Poly(A)-Schwanz von etwa 100–150 Nukleotiden den besten Kompromiss zwischen Transkriptstabilität, Translationseffizienz und Resistenz gegenüber zytoplasmatischem Abbau bietet. Überverlängerung kann die Transkriptfaltung und Translation beeinflussen, und kürzere Schwänze können die Stabilität beeinträchtigen.

Die Polyadenylierung ist ein wesentlicher Determinant der mRNA-Halbwertszeit und der Rekrutierung an den ribosomalen Komplex in eukaryotischen Zellen.

DNase-Behandlung

Restliche DNA-Vorlagen aus IVT-Reaktionen müssen strikt entfernt werden, um regulatorische Vorgaben zu erfüllen, eine Aktivierung des angeborenen Immunsystems zu verhindern und Hintergrundsignale in funktionellen Assays zu eliminieren.

• Turbo DNase (rekombinante RNase-freie DNase I): Hydrolysiert effizient einzel- und doppelsträngige DNA unter Bedingungen, die die RNA-Integrität erhalten. Diese Behandlung erfolgt typischerweise nach der IVT und nach der Polyadenylierung, gefolgt von Hitzoinaktivierung oder Reinigung zur Entfernung des Enzyms.

Die DNase-Behandlung ist nicht nur für therapeutische Anwendungen essenziell, sondern auch für analytische Workflows wie RT-qPCR, bei denen DNA-Kontaminationen die Quantifizierung verfälschen können.

mRNA-Reinigung

Die Reinigung ist arguably der kritischste Schritt bei der Herstellung von mRNA in therapeutischer Qualität. Ziel ist die Entfernung von Verunreinigungen wie Proteinen, Rest-DNA, verkürzten Transkripten, Nukleotiden, Enzymen und Endotoxinen. Zur Erreichung der erforderlichen Qualitäts- und regulatorischen Standards werden verschiedene Reinigungsstrategien eingesetzt, häufig in Kombination.

Fällungsmethoden

Die Fällung ist aufgrund ihrer Einfachheit, Skalierbarkeit und Kosteneffizienz weiterhin eine weit verbreitete primäre Reinigungsmethode.

• Lithiumchlorid-(LiCl)-Fällung: LiCl fällt selektiv lange RNA-Spezies aus, während die meisten Proteine, kurzen RNA-Fragmente, freien Nukleotide und Salze im Überstand verbleiben. Das Standardprotokoll umfasst eine Inkubation bei 4°C, gefolgt von Hochgeschwindigkeitszentrifugation.
• Ethanolfällung: Üblicherweise in Kombination mit Salzen (z. B. Natriumacetat) eingesetzt; die Ethanolfällung ermöglicht eine effiziente Rückgewinnung von RNA aus verdünnten Lösungen. Dieser Schritt ist besonders nützlich für Pufferwechsel und Entsalzung vor enzymatischer Prozessierung oder chromatographischer Reinigung.

Obwohl Fällung keine hochauflösende Trennung bietet, wird sie häufig in mehrstufige Reinigungsprotokolle integriert, um grobe Verunreinigungen zu reduzieren.

Chromatographische Reinigung

Chromatographiebasierte Verfahren bieten eine überlegene Auflösung und Spezifität zur Isolierung vollängiger, hochreiner mRNA-Transkripte.

• Oligo(dT)-Affinitätschromatographie: Nutzt die Affinität zwischen Poly(A)-Schwänzen und oligo(dT)-konjugierten Harzen (z. B. Sepharose oder magnetische Beads). Dieser Ansatz bindet selektiv polyadenylierte Transkripte und entfernt verkürzte RNAs sowie nicht-polyadenylierte Kontaminanten. Besonders effektiv zur Reinigung von mRNA aus gesamten IVT-Mischungen.
• Größenausschlusschromatographie (SEC): Trennt Moleküle anhand ihres hydrodynamischen Radius. SEC kann kurze Transkripte, degradierte RNA und nicht inkorporierte Nukleotide effektiv entfernen und dabei die native Konformation vollängiger mRNA erhalten.
• Ionenaustauschchromatographie (IEX): Trennt Nukleinsäuren nach Nettoladung. Anionenaustauscherharze (z. B. DEAE oder Q-Sepharose) werden häufig unter Niedrigsalzbedingungen eingesetzt. Durch Feinabstimmung von Salzgradienten lassen sich gecappte vs. uncappte mRNA sowie vollängige vs. verkürzte Produkte trennen.

Chromatographische Verfahren sind besonders hilfreich bei der Herstellung klinischer mRNA, die eine hohe Chargen-zu-Chargen-Konsistenz erfordert.

Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC)

HPLC ist ein leistungsfähiges analytisches und präparatives Werkzeug in der mRNA-Reinigung und ermöglicht die Trennung von mRNA-Isoformen, Verunreinigungen und strukturell ähnlichen Spezies.

• Reversed-Phase-HPLC (RP-HPLC): Basierend auf hydrophoben Wechselwirkungen zwischen RNA und der Säulenmatrix. Typischerweise wird eine C18-Säule und Ion-Pairing-Reagenzien (z. B. Triethylammoniumacetat) zur Erhöhung der Auflösung verwendet. RP-HPLC eignet sich hervorragend zur Auftrennung modifizierter und unmodifizierter mRNA, verkürzter Spezies und residualer enzymatischer Proteine.
• Hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC): Nützlich zur Unterscheidung von gecappter und uncappter RNA anhand von Unterschieden in der Hydrophobizität. HIC wird häufig als Qualitätskontrollinstrument oder als sekundärer Reinigungsschritt zur Erhöhung der Endreinheit eingesetzt.

Diese Methoden sind in Qualitätssicherungs-(QA)-Umgebungen wertvoll und werden häufig in GMP-konforme Herstellprozesse für mRNA-basierte Therapeutika integriert.

Filtrationsbasierte Methoden

Tangentialflussfiltration (TFF) ist eine skalierbare und effiziente Methode für Pufferwechsel, RNA-Konzentrierung und Entfernung von Verunreinigungen. TFF-Systeme nutzen Hohlfaser- oder Flachmembranen mit definierten Molekulargewichts-Cut-offs, um RNA zurückzuhalten und gleichzeitig kleine Moleküle und Salze passieren zu lassen.

TFF wird häufig sowohl in Upstream- als auch Downstream-Prozessschritten eingesetzt, insbesondere in der großtechnischen mRNA-Produktion. Das Verfahren ist mit kontinuierlichen Herstellstrategien kompatibel und eignet sich gut für Hochdurchsatzprozesse.

Abbildung 4. Zusammenfassung der Herstellung funktioneller mRNA. (Papaioannou et al., 2023)

Die mRNA-Produktionskette ist ein streng kontrollierter Prozess, der die Vorbereitung der DNA-Vorlage, IVT, Capping, Reinigung und eine rigorose Qualitätskontrolle umfasst. Fortschritte bei enzymatischen Modifikationen, chromatographischer Reinigung und analytischen Verfahren haben Ausbeute, Stabilität und Translationseffizienz von mRNA signifikant verbessert. Mit der Weiterentwicklung regulatorischer Rahmenbedingungen und dem Aufkommen neuer Technologien wird sich die mRNA-Herstellung weiter verbessern und breitere therapeutische Anwendungen ermöglichen.

Bei Creative Enzymes stellen wir die leistungsstarken Enzyme bereit, die in jedem Schritt der mRNA-Produktionskette benötigt werden – einschließlich Plasmidlinearisierung, In-vitro-Transkription, Capping und Polyadenylierung. Kontaktieren Sie uns noch heute mit Ihren Fragen und Anliegen!