Die Einführung von mRNA-basierten Impfstoffen und Therapeutika hat die moderne Medizin revolutioniert, wie die rasche Entwicklung der COVID-19-Impfstoffe eindrucksvoll zeigt. Im Gegensatz zu herkömmlichen Biologika bietet mRNA eine flexible und schnelle Produktionsplattform, die in der Lage ist, praktisch jedes gewünschte Protein zu kodieren. Die Herstellung von hochwertiger mRNA erfordert jedoch eine strenge Kontrolle jedes Schrittes der Produktionspipeline, um Wirksamkeit, Stabilität und Sicherheit zu gewährleisten.

Bei Creative Enzymes bieten wir verschiedene Enzyme für die mRNA-Produktion an, darunter T7-RNA-Polymerase, RNase-Inhibitor, DNase I, Vaccinia-Capping-Enzym und mehr. Im Folgenden stellen wir den mRNA-Produktionsprozess systematisch vor und heben dabei kritische Parameter hervor, die Ausbeute, Reinheit und Funktionalität beeinflussen.

Abbildung 1. Der Prozess der in vitro Transkription von mRNA aus einer linearisierten DNA-Plasmid-Vorlage. (Knezevic et al., 2021)

DNA-Vorlagenvorbereitung

Effiziente in vitro Transkription (IVT) zur Herstellung synthetischer mRNA beginnt mit der sorgfältigen Vorbereitung einer DNA-Vorlage, meist in Form eines konstruierten Plasmids. Diese Vorlage dient als Bauplan für die Transkription und beeinflusst direkt die Genauigkeit, Stabilität und Translationseffizienz des resultierenden mRNA-Produkts.

Plasmiddesign und -konstruktion

Das als DNA-Vorlage verwendete Plasmid ist ein synthetisches Konstrukt, das für optimale Transkription und nachgelagerte Translationstätigkeit ausgelegt ist. Ein typisches mRNA-kodierendes Plasmid besteht aus folgenden Kernelementen:

• Promotorsequenz: Dies ist die Bindungsstelle für eine DNA-abhängige RNA-Polymerase, typischerweise abgeleitet von Bakteriophagen wie T7, SP6 oder T3. Der Promotor ermöglicht eine hochgradige in vitro Transkription und ist meist direkt stromaufwärts der 5'-untranslatierten Region (UTR) positioniert.
• 5'-Untranslatierte Region (5' UTR): Für optimale ribosomale Rekrutierung konstruiert, erhöht die 5' UTR die Translationseffizienz. Wichtige Merkmale sind Kozak-Konsensussequenzen und minimale Sekundärstruktur, um das Ribosom-Scanning zu erleichtern.
• Offener Leserahmen (ORF): Dies ist die kodierende Sequenz für das gewünschte Protein. Eine an das Zielwirtssystem angepasste Codon-Optimierung wird eingesetzt, um die Translationseffizienz zu verbessern und potenzielle Immunogenität zu reduzieren.
• 3'-Untranslatierte Region (3' UTR): Die 3' UTR enthält Sequenzelemente, die die Stabilität der mRNA und die Translation regulieren. Häufige Stabilitätsmotive stammen aus menschlichen β-Globin- oder α-Globin-Genen.
• Polyadenylierungssignal und Poly(A)-Schwanz: Entweder im Plasmid kodiert oder posttranskriptionell hinzugefügt, erhöht eine Strecke von 70–120 Adenosinresten am 3'-Ende die Stabilität und Translationseffizienz der mRNA, indem sie natürliche eukaryotische Transkripte imitiert.

Wichtige Designüberlegungen:

• Codon-Optimierung: Der Austausch seltener Codons durch synonyme, im Ziel-Expressionssystem bevorzugte Codons erhöht die Translation, ohne die Aminosäuresequenz zu verändern.
• Vermeidung immunogener Motive: Das Vorhandensein unmethylierter CpG-Inseln, Poly(U)-Sequenzen oder anderer Pathogen-assoziierter molekularer Muster (PAMPs) kann angeborene Immunantworten auslösen. Diese Sequenzen werden während des Sequenzengineerings minimiert oder entfernt.

Plasmidvermehrung und -reinigung

Nach dem Design muss das konstruierte Plasmid in großem Maßstab vermehrt und gereinigt werden, um es in Transkriptionsreaktionen einzusetzen.

• Bakterielle Amplifikation: Das Plasmid wird durch Transformation in einen Hochkopienstamm von Escherichia coli (z. B. DH5α) eingebracht. Die Kulturen werden in Anwesenheit selektiver Antibiotika (Ampicillin, Kanamycin usw.) gezüchtet, um den Plasmiderhalt sicherzustellen.
• Plasmidreinigung: Bakterienkulturen werden geerntet und Plasmide mittels alkalischer Lyse und anschließender Reinigungsschritte extrahiert. Kommerzielle Kits auf Silika-Säulen-Basis sind weit verbreitet. Für Anwendungen, die ultrapure DNA erfordern (z. B. therapeutische mRNA), kann eine CsCl-Gradienten-Ultrazentrifugation eingesetzt werden.

Qualitätskontrollmaßnahmen:

• Agarose-Gelelektrophorese: Bestätigt die Integrität des Plasmids und das Überwiegen der superhelikalen Form, die am transkriptionell kompetentesten ist.
• Spektrophotometrie (A260/A280- und A260/A230-Verhältnisse): Bestimmt DNA-Konzentration und Reinheit. Akzeptable Reinheitsverhältnisse sind in der Regel ~1,8 für A260/A280 und >2,0 für A260/A230.

Linearisierung der Plasmid-DNA

Plasmid-DNA muss vor der IVT linearisiert werden, um Readthrough-Transkription zu verhindern und einheitliche mRNA-Transkripte zu erhalten.

• Restriktionsenzym-Verdau: Eine einzigartige Schnittstelle stromabwärts des Poly(A)-Schwanzes wird mit Enzymen wie BspQI, ApaI oder NotI geschnitten. Die Wahl des Enzyms hängt vom Plasmiddesign und der gewünschten Endkonfiguration ab.
• Endeigenschaften: Um unerwünschte Transkriptionsartefakte zu vermeiden, werden Enzyme bevorzugt, die stumpfe Enden oder 5'-Überhänge erzeugen, anstatt solche mit 3'-Überhängen.
• Vorlagenreinigung: Nach dem Verdau werden Enzyme und kleine Fragmente durch Phenol-Chloroform-Extraktion gefolgt von Ethanol-Fällung oder säulenbasierter Reinigung (z. B. Silika-Spin-Säulen) entfernt. Die finale Vorlage sollte hochrein, RNase-frei und frei von unverdautem Plasmid sein.

In vitro Transkription (IVT)

Der IVT-Prozess synthetisiert mRNA in vitro durch das Kopieren einer linearen DNA-Vorlage mit phagenabgeleiteten RNA-Polymerasen. Eine hochgradige, fehlerarme mRNA-Synthese ist entscheidend für Anwendungen von funktioneller Proteinexpression bis hin zur Herstellung therapeutischer RNA.

Reaktionskomponenten

Eine Standard-IVT-Reaktion umfasst:

• RNA-Polymerase: T7-, SP6- oder T3-RNA-Polymerasen werden je nach entsprechendem Promotor in der Vorlage verwendet. T7-Polymerase ist am gebräuchlichsten aufgrund ihrer hohen Transkriptionseffizienz.
• Nukleotid-Triphosphate (NTPs): Äquimolare Konzentrationen von ATP, GTP, CTP und UTP, typischerweise im Bereich von 4–8 mM, liefern die Bausteine für die RNA-Synthese.
• Reaktionspuffer: Enthält essentielle Kofaktoren wie Magnesiumionen (Mg²⁺), Dithiothreitol (DTT) zur Aufrechterhaltung des Redoxgleichgewichts und Spermidin zur Stabilisierung von Nukleinsäuren.
• RNase-Inhibitoren: RNase-Inhibitoren werden hinzugefügt, um die neu gebildete RNA während der Transkription vor Abbau zu schützen.

Abbildung 2. Saccharomyces cerevisiae RNAP II CTD. (Pal, 2020)

Optimierung der IVT-Bedingungen

• NTP-Konzentration: Zu hohe NTP-Konzentrationen können zu vorzeitigem Abbruch oder verkürzten Transkripten führen, während zu niedrige Konzentrationen die Ausbeute begrenzen. Eine ausgewogene Konzentration (~4–8 mM) ist optimal.
• Magnesiumionenkonzentration: Mg²⁺ ist entscheidend für die Polymeraseaktivität und Genauigkeit. Optimale Konzentrationen liegen zwischen 20–30 mM und müssen je nach Vorlage und Maßstab titriert werden.
• Inkubationsparameter: Standard-IVT-Reaktionen werden bei 37°C für 2–4 Stunden durchgeführt. Längere Inkubation kann die Ausbeute erhöhen, aber auch das Risiko von RNA-Abbau oder Verunreinigungen steigern.

Kotranskriptionelle Modifikationen

Um die Translationseffizienz zu verbessern und die Immunogenität synthetischer mRNA zu reduzieren, können verschiedene Modifikationen direkt während der Transkription eingebracht werden.

Strategien für das 5'-Capping:

• Cap 0 (m⁷GpppG): Die einfachste Form der eukaryotischen mRNA-Kappe. Wird oft im molaren Überschuss zu GTP hinzugefügt, um eine effektive Einbindung zu gewährleisten.
• ARCA (Anti-Reverse Cap Analog): Verhindert die umgekehrte Kappenintegration und stellt die korrekte 5'-Endausrichtung sicher, was die Ribosomerkennung verbessert.

Nukleotidmodifikationen:

• Pseudouridin (Ψ) und N1-Methylpseudouridin (m¹Ψ): Diese Analoga reduzieren die angeborene Immunerkennung (z. B. durch TLR7/8) und erhöhen die Translationseffizienz.
• 5-Methylcytidin (m⁵C): Verbessert die Stabilität der mRNA durch Resistenz gegen Nukleaseabbau und trägt zur Optimierung der Translation bei.
• Weitere Modifikationen (z. B. 2-Thiouridin, N6-Methyladenosin) werden für das therapeutische mRNA-Engineering erforscht, um die Pharmakokinetik zu verbessern und entzündliche Signale zu reduzieren.

Posttranskriptionelle Verarbeitung

Nach der in vitro Transkription (IVT) muss die resultierende RNA eine Reihe posttranskriptioneller Modifikationen und Reinigungsschritte durchlaufen, um eine reife, stabile und translationskompetente Boten-RNA (mRNA) zu erhalten. Diese Prozesse stellen sicher, dass das synthetische Transkript die natürliche eukaryotische mRNA sowohl in Struktur als auch Funktion nachahmt und so die Wirksamkeit in nachgelagerten Anwendungen wie Proteinexpression und mRNA-basierten Therapeutika maximiert.

Enzymatisches Capping (falls nicht kotranskriptionell durchgeführt)

Während kotranskriptionelle Capping-Strategien oder die Verwendung von Anti-Reverse Cap Analogs (ARCAs) zunehmend bevorzugt werden, bleibt das enzymatische Capping eine robuste Alternative, insbesondere für Forschungs- und therapeutische mRNA-Produktion, bei der eine präzise Kontrolle der Capping-Effizienz und -Genauigkeit erforderlich ist.

• Vaccinia-Capping-Enzym (VCE): Dieser multifunktionale Enzymkomplex katalysiert die sequentielle enzymatische Addition einer 5'-Kappenstruktur, bekannt als Cap 0 (m⁷GpppN), wobei "m⁷G" für 7-Methylguanosin steht, das über eine 5'-5'-Triphosphatbrücke mit dem ersten transkribierten Nukleotid verbunden ist. Die VCE-Aktivität umfasst RNA-Triphosphatase-, Guanylyltransferase- und (Guanin-N7)-Methyltransferase-Funktionen. Die Kappe spielt eine entscheidende Rolle für die Transkriptstabilität, effiziente Translationsinitiation und Resistenz gegen exonukleolytischen Abbau.
• 2'-O-Methyltransferase: Wandelt Cap 0 in Cap 1 (m⁷GpppNm) um, indem sie die Ribose-2'-Hydroxylgruppe des ersten transkribierten Nukleotids methyliert. Cap 1-Strukturen werden vom Immunsystem als "selbst" erkannt und reduzieren so signifikant angeborene Immunantworten, die durch Toll-like-Rezeptoren (TLRs), RIG-I und MDA5 vermittelt werden.

Das enzymatische Capping ermöglicht eine nahezu quantitative Umwandlung von ungekappter RNA in die vollständig gekappte Cap 1-Struktur, was besonders für empfindliche Anwendungen wie Impfstoffentwicklung und Gentherapien nützlich ist.

Abbildung 3. Sequentielle enzymatische Aktivitäten, die zur RNA-5'-Endkappe führen. (Pal, 2020)

Poly(A)-Tailing

Fehlt im Plasmid-DNA eine kodierte Polyadenylierungssequenz, muss der 3'-Poly(A)-Schwanz posttranskriptionell enzymatisch hinzugefügt werden.

• Poly(A)-Polymerase (PAP): Katalysiert die vorlagenunabhängige Addition von Adenosinmonophosphaten an das 3'-Hydroxylende des RNA-Transkripts. Diese enzymatische Reaktion verwendet typischerweise ATP als Substrat und wird in optimierten Puffersystemen durchgeführt, um Homogenität und angemessene Schwanzlänge sicherzustellen.
• Optimale Poly(A)-Schwanzlänge: Empirische Studien zeigen, dass ein etwa 100–150 Nukleotide langer Poly(A)-Schwanz den besten Kompromiss zwischen Transkriptstabilität, Translationseffizienz und Resistenz gegen zytoplasmatischen Abbau bietet. Eine Überlängung kann die Faltung und Translation des Transkripts beeinträchtigen, während kürzere Schwänze die Stabilität verringern können.

Die Polyadenylierung ist ein entscheidender Faktor für die Halbwertszeit der mRNA und deren Rekrutierung zum ribosomalen Komplex in eukaryotischen Zellen.

DNase-Behandlung

Restliche DNA-Vorlagen aus IVT-Reaktionen müssen streng entfernt werden, um regulatorische Vorgaben einzuhalten, angeborene Immunaktivierung zu verhindern und Hintergrund in funktionellen Assays zu eliminieren.

• Turbo DNase (rekombinante RNase-freie DNase I): Spaltet effizient Einzel- und Doppelstrang-DNA unter Bedingungen, die die RNA-Integrität erhalten. Diese Behandlung erfolgt typischerweise nach IVT und Polyadenylierung, gefolgt von Hitzedenaturierung oder Reinigung zur Entfernung des Enzyms.

Die DNase-Behandlung ist nicht nur für therapeutische Anwendungen, sondern auch für analytische Workflows wie RT-qPCR unerlässlich, da DNA-Kontamination die Quantifizierung verfälschen kann.

mRNA-Reinigung

Die Reinigung ist wohl der kritischste Schritt bei der Herstellung von therapeutischer mRNA. Ziel ist es, Verunreinigungen wie Proteine, Rest-DNA, verkürzte Transkripte, Nukleotide, Enzyme und Endotoxine zu entfernen. Es werden verschiedene Reinigungsstrategien, oft in Kombination, eingesetzt, um die erforderliche Qualität und regulatorische Standards zu erreichen.

Fällungsmethoden

Die Fällung ist aufgrund ihrer Einfachheit, Skalierbarkeit und Kosteneffizienz eine weit verbreitete primäre Reinigungsmethode.

• Lithiumchlorid (LiCl)-Fällung: LiCl fällt selektiv lange RNA-Spezies aus, während die meisten Proteine, kurze RNA-Fragmente, freie Nukleotide und Salze im Überstand verbleiben. Das Standardprotokoll umfasst eine Inkubation bei 4°C, gefolgt von Hochgeschwindigkeitszentrifugation.
• Ethanol-Fällung: Wird typischerweise in Kombination mit Salzen (z. B. Natriumacetat) eingesetzt und ermöglicht eine effiziente Rückgewinnung von RNA aus verdünnten Lösungen. Dieser Schritt ist besonders nützlich für den Pufferwechsel und die Entsalzung vor enzymatischer Verarbeitung oder chromatographischer Reinigung.

Obwohl die Fällung keine hochauflösende Trennung bietet, ist sie oft Teil mehrstufiger Reinigungsprotokolle zur Reduktion von Massenverunreinigungen.

Chromatographische Reinigung

Chromatographiebasierte Techniken bieten eine überlegene Auflösung und Spezifität für die Isolierung von voll-längigen, hochreinen mRNA-Transkripten.

• Oligo(dT)-Affinitätschromatographie: Nutzt die Affinität zwischen Poly(A)-Schwänzen und oligo(dT)-konjugierten Harzen (z. B. Sepharose oder magnetische Beads). Dieser Ansatz selektiert polyadenylierte Transkripte und entfernt verkürzte RNAs sowie nicht-polyadenylierte Verunreinigungen. Besonders effektiv zur Reinigung von mRNA aus IVT-Gesamtgemischen.
• Größenausschlusschromatographie (SEC): Trennt Moleküle nach hydrodynamischem Radius. SEC kann kurze Transkripte, degradierte RNA und nicht eingebaute Nukleotide effektiv entfernen und erhält dabei die native Konformation der voll-längigen mRNA.
• Ionenaustauschchromatographie (IEX): Trennt Nukleinsäuren nach Nettoladung. Anionenaustauscherharze (z. B. DEAE oder Q-Sepharose) werden unter Niedrigsalzbedingungen verwendet. Durch Feinabstimmung der Salzgradienten können gekappte von ungekappter mRNA sowie voll-längige von verkürzten Produkten getrennt werden.

Chromatographische Techniken sind besonders nützlich bei der Herstellung von klinischer mRNA, die eine hohe Chargenkonsistenz erfordert.

Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC)

HPLC ist ein leistungsfähiges analytisches und präparatives Werkzeug in der mRNA-Reinigung und ermöglicht die Trennung von mRNA-Isoformen, Verunreinigungen und strukturell ähnlichen Spezies.

• Reverse-Phase-HPLC (RP-HPLC): Basierend auf hydrophoben Wechselwirkungen zwischen RNA und der Säulenmatrix. Verwendet typischerweise eine C18-Säule und Ion-Pairing-Reagenzien (z. B. Triethylammoniumacetat) zur Verbesserung der Auflösung. RP-HPLC eignet sich hervorragend zur Trennung von modifizierter und unmodifizierter mRNA, verkürzten Spezies und restlichen Enzymproteinen.
• Hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC): Nützlich zur Unterscheidung von gekappter und ungekappter RNA basierend auf Unterschieden in der Hydrophobizität. HIC wird häufig als Qualitätskontrollwerkzeug oder als sekundärer Reinigungsschritt zur Erhöhung der Endreinheit eingesetzt.

Diese Methoden sind in der Qualitätssicherung (QA) wertvoll und werden häufig in GMP-Pipelines für mRNA-basierte Therapeutika integriert.

Filtrationsbasierte Methoden

Tangentialflussfiltration (TFF) ist eine skalierbare und effiziente Methode für Pufferwechsel, RNA-Konzentration und Entfernung von Verunreinigungen. TFF-Systeme verwenden Hohlfaser- oder Flachmembranen mit definierten Molekulargewichtsausschlüssen, um RNA zurückzuhalten, während kleine Moleküle und Salze passieren können.

TFF wird häufig sowohl in der Upstream- als auch in der Downstream-Verarbeitung eingesetzt, insbesondere bei der großtechnischen mRNA-Produktion. Sie ist mit kontinuierlichen Herstellungsstrategien kompatibel und eignet sich gut für Hochdurchsatzanwendungen.

Abbildung 4. Zusammenfassung der Herstellung funktioneller mRNA. (Papaioannou et al., 2023)

Die mRNA-Produktionspipeline ist ein sorgfältig kontrollierter Prozess, der DNA-Vorlagenvorbereitung, IVT, Capping, Reinigung und strenge Qualitätskontrolle umfasst. Fortschritte bei enzymatischen Modifikationen, chromatographischer Reinigung und analytischen Techniken haben die Ausbeute, Stabilität und Translationseffizienz von mRNA erheblich verbessert. Mit der Weiterentwicklung regulatorischer Rahmenbedingungen und dem Aufkommen neuer Technologien wird die mRNA-Herstellung weiter optimiert und ermöglicht breitere therapeutische Anwendungen.

Bei Creative Enzymes bieten wir die Hochleistungsenzyme, die für jeden Schritt der mRNA-Produktionspipeline erforderlich sind – einschließlich Plasmid-Linearisation, in vitro Transkription, Capping und Polyadenylierung. Kontaktieren Sie uns noch heute mit Ihren Fragen und Anfragen!