Die Einführung von mRNA-basierten Impfstoffen und Therapeutika hat die moderne Medizin revolutioniert, wie die schnelle Entwicklung von COVID-19-Impfstoffen zeigt. Im Gegensatz zu traditionellen Biologika bietet mRNA eine flexible und schnelle Produktionsplattform, die in der Lage ist, praktisch jedes Protein von Interesse zu kodieren. Die Herstellung von hochwertiger mRNA erfordert jedoch strenge Kontrollen über jeden Schritt der Produktionspipeline, um Wirksamkeit, Stabilität und Sicherheit zu gewährleisten.

Bei Creative Enzymes bieten wir verschiedene Enzyme für die mRNA-Produktion an, darunter T7-RNA-Polymerase, RNase-Inhibitor, DNase I, Vaccinia-Capping-Enzym und mehr. Hier stellen wir systematisch den mRNA-Produktionprozess vor und betonen kritische Parameter, die den Ertrag, die Reinheit und die Funktionalität beeinflussen.

Abbildung 1. Der Prozess der in vitro Transkription von mRNA, die aus einer linearisierten DNA-Plasmidvorlage hergestellt wurde. (Knezevic et al., 2021)

DNA-Vorlagenvorbereitung

Effiziente in vitro Transkription (IVT) zur synthetischen mRNA-Produktion beginnt mit der sorgfältigen Vorbereitung einer DNA-Vorlage, die am häufigsten in Form eines konstruierten Plasmids vorliegt. Diese Vorlage dient als Blaupause für die Transkription und beeinflusst direkt die Genauigkeit, Stabilität und translationalen Effizienz des resultierenden mRNA-Produkts.

Plasmid-Design und -Engineering

Das Plasmid, das als DNA-Vorlage verwendet wird, ist ein synthetisches Konstrukt, das so entworfen wurde, dass es eine optimale Transkription und nachfolgende Translationstätigkeit gewährleistet. Ein typisches mRNA-kodierendes Plasmid besteht aus den folgenden Kernelementen:

• Promotorsequenz: Dies ist die Bindungsstelle für eine DNA-abhängige RNA-Polymerase, die typischerweise von Bakteriophagen wie T7, SP6 oder T3 stammt. Der Promotor treibt eine hochgradige in vitro Transkription an und ist oft unmittelbar stromaufwärts der 5' untranslatierten Region (UTR) positioniert.
• 5' Untranslatierte Region (5' UTR): Für eine optimale ribosomale Rekrutierung konstruiert, verbessert die 5' UTR die Translationseffizienz. Wichtige Merkmale sind Kozak-Konsenssequenzen und minimale Sekundärstruktur, um das Scannen durch das Ribosom zu erleichtern.
• Offene Leserahmen (ORF): Dies ist die kodierende Sequenz für das interessierende Protein. Die Kodonoptimierung, die auf die translationalen Maschinen des Zielwirts abgestimmt ist, wird eingesetzt, um die Translationseffizienz zu verbessern und potenzielle Immunogenität zu reduzieren.
• 3' Untranslatierte Region (3' UTR): Die 3' UTR enthält Sequenzelemente, die die mRNA-Stabilität und die translationale Kontrolle regulieren. Häufige Stabilitätsmotive stammen von menschlichen β-Globin- oder α-Globin-Genen.
• Polyadenylierungssignal und Poly(A)-Schwanz: Entweder im Plasmid kodiert oder posttranskriptionell hinzugefügt, verbessert ein Abschnitt von 70–120 Adenosin-Resten am 3'-Ende die mRNA-Stabilität und die translationale Effizienz, indem er natürliche eukaryotische Transkripte imitiert.

Wichtige Designüberlegungen:

• Kodonoptimierung: Der Austausch seltener Kodons durch synonyme Kodons, die im Ziel-Expressionssystem bevorzugt werden, verbessert die Translation, ohne die Aminosäuresequenz zu verändern.
• Vermeidung immunogener Motive: Das Vorhandensein von unmethylierte CpG-Inseln, Poly(U)-Sequenzen oder anderen pathogenassoziierten molekularen Mustern (PAMPs) kann angeborene Immunantworten stimulieren. Diese Sequenzen werden während der Sequenzgestaltung minimiert oder eliminiert.

Plasmidvermehrung und -reinigung

Nach dem Design muss das konstruierte Plasmid in großem Maßstab vermehrt und gereinigt werden, um es in Transkriptionsreaktionen zu verwenden.

• Bakterielle Amplifikation: Das Plasmid wird durch Transformation in einen Hochkopie-Stamm von Escherichia coli (z. B. DH5α) eingeführt. Kulturen werden in Anwesenheit selektiver Antibiotika (Ampicillin, Kanamycin usw.) gezüchtet, um die Plasmidretention sicherzustellen.
• Plasmidreinigung: Bakterienkulturen werden geerntet, und Plasmide werden unter Verwendung von alkalischen Lysemethoden gefolgt von Reinigungsschritten extrahiert. Kommerzielle Kits auf Silica-Säulenbasis sind weit verbreitet. Für Forschungszwecke, die ultra-reines DNA erfordern (z. B. für therapeutische mRNA), kann die Zentrifugation mit Cäsiumchlorid (CsCl) Gradient eingesetzt werden.

Qualitätskontrollmaßnahmen:

• Agarose-Gelelektrophorese: Bestätigt die Integrität des Plasmids und die Vorherrschaft der supercoiled Form, die am transkriptionell kompetentesten ist.
• Spektrophotometrie (A260/A280 und A260/A230 Verhältnisse): Bewertet die DNA-Konzentration und Reinheit. Akzeptable Reinheitsverhältnisse liegen in der Regel bei ~1,8 für A260/A280 und >2,0 für A260/A230.

Linearisation der Plasmid-DNA

Die Plasmid-DNA muss vor der IVT linearisiert werden, um Durchlauftranskription zu verhindern und einheitliche mRNA-Transkripte zu erzeugen.

• Restriktionsenzymverdau: Eine einzigartige Restriktionsstelle stromabwärts des Poly(A)-Schwanzes wird mit Enzymen wie BspQI, ApaI oder NotI angegriffen. Die Wahl des Enzyms hängt vom Plasmiddesign und der gewünschten Endkonfiguration ab.
• Endmerkmale: Um unerwünschte transkriptionale Artefakte zu verhindern, werden Enzyme, die stumpfe Enden oder 5'-Überhänge erzeugen, denjenigen vorgezogen, die 3'-Überhänge erzeugen.
• Vorlagenreinigung: Nach dem Verdau werden Enzyme und kleine Fragmente durch Phenol-Chloroform-Extraktion gefolgt von Ethanolpräzipitation oder säulenbasierter Reinigung (z. B. Silica-Spinsäulen) entfernt. Die endgültige Vorlage sollte hochrein, RNase-frei und frei von unverdautem Plasmid sein.

In Vitro Transkription (IVT)

Der IVT-Prozess synthetisiert mRNA in vitro, indem eine lineare DNA-Vorlage unter Verwendung von phagenabgeleiteten RNA-Polymerasen kopiert wird. Die Synthese von mRNA mit hohem Ertrag und hoher Genauigkeit ist entscheidend für Anwendungen, die von der funktionellen Proteinexpression bis zur Herstellung therapeutischer RNA reichen.

Reaktionskomponenten

Eine Standard-IVT-Reaktion umfasst:

• RNA-Polymerase: T7, SP6 oder T3 RNA-Polymerasen werden basierend auf dem entsprechenden Promotor in der Vorlage verwendet. T7-Polymerase ist am häufigsten aufgrund ihrer hohen transkriptionellen Effizienz.
• Nukleotidtriphosphate (NTPs): Äquimolare Konzentrationen von ATP, GTP, CTP und UTP, typischerweise im Bereich von 4–8 mM, liefern die Bausteine für die RNA-Synthese.
• Reaktionspuffer: Enthält essentielle Cofaktoren wie Magnesiumionen (Mg²⁺), Dithiothreitol (DTT), um das Redox-Gleichgewicht aufrechtzuerhalten, und Spermidin, um Nukleinsäuren zu stabilisieren.
• RNase-Inhibitoren: RNase-Inhibitoren werden hinzugefügt, um naszierende RNA während des Transkriptionsprozesses vor Abbau zu schützen.

Abbildung 2. Saccharomyces cerevisiae RNAP II CTD. (Pal, 2020)

Optimierung der IVT-Bedingungen

• NTP-Konzentration: Übermäßig hohe NTP-Konzentrationen können zu vorzeitigen Terminationen oder verkürzten Transkripten führen, während unzureichende Mengen den Ertrag begrenzen können. Eine ausgewogene Konzentration (~4–8 mM) ist optimal.
• Magnesiumionenkonzentration: Mg²⁺ ist entscheidend für die Polymeraseaktivität und -genauigkeit. Optimale Konzentrationen liegen zwischen 20–30 mM und können je nach Vorlage und Maßstab titriert werden.
• Inkubationsparameter: Standard-IVT-Reaktionen werden bei 37 °C für 2–4 Stunden durchgeführt. Eine verlängerte Inkubation kann den Ertrag erhöhen, erhöht jedoch auch das Risiko von RNA-Abbau oder Verunreinigungsbildung.

Ko-Transkriptionale Modifikationen

Um die translationalen Leistungen zu verbessern und die Immunogenität synthetischer mRNA zu reduzieren, können mehrere Modifikationen direkt während der Transkription integriert werden.

5'-Capping-Strategien:

• Cap 0 (m⁷GpppG): Die einfachste Form des eukaryotischen mRNA-Caps. Oft in molarem Überschuss zu GTP hinzugefügt, um eine effektive Incorporation sicherzustellen.
• ARCA (Anti-Reverse Cap Analog): Verhindert die Incorporation von Reverse-Caps und stellt die korrekte 5'-Endorientierung sicher, was die Ribosomen-Erkennung verbessert.

Nukleotidmodifikationen:

• Pseudouridin (Ψ) und N1-Methylpseudouridin (m¹Ψ): Diese Analoga reduzieren die Erkennung durch das angeborene Immunsystem (z. B. durch TLR7/8) und verbessern die translationale Effizienz.
• 5-Methylcytidin (m⁵C): Verbessert die mRNA-Stabilität, indem es dem Abbau durch Nukleasen widersteht und zur Optimierung der Translation beiträgt.
• Weitere Modifikationen (z. B. 2-Thiouridin, N6-Methyladenosin) werden für die therapeutische mRNA-Engineering untersucht, um die Pharmakokinetik zu verbessern und entzündliche Signale zu reduzieren.

Posttranskriptionale Verarbeitung

Nach der in vitro Transkription (IVT) muss die resultierende RNA eine Reihe von posttranskriptionalen Modifikationen und Reinigungsschritten durchlaufen, um eine reife, stabile und translationale kompetente Messenger-RNA (mRNA) zu erhalten. Diese Prozesse stellen sicher, dass das synthetische Transkript die natürliche eukaryotische mRNA sowohl in Struktur als auch in Funktion imitiert, wodurch ihre Wirksamkeit in nachgelagerten Anwendungen wie der Proteinexpression und mRNA-basierten Therapeutika maximiert wird.

Enzymatisches Capping (falls nicht ko-transkriptionell durchgeführt)

Obwohl ko-transkriptionale Capping-Strategien oder die Verwendung von Anti-Reverse-Cap-Analoga (ARCAs) zunehmend bevorzugt werden, bleibt enzymatisches Capping eine robuste Alternative, insbesondere für die Produktion von Forschungs- und therapeutischer mRNA, bei der eine präzise Kontrolle über die Capping-Effizienz und -Genauigkeit erforderlich ist.

• Vaccinia-Capping-Enzym (VCE): Dieses multifunktionale Enzymkomplex katalysiert die sequenzielle enzymatische Addition einer 5'-Capping-Struktur, die als Cap 0 (m⁷GpppN) bekannt ist, wobei "m⁷G" ein 7-Methylguanosin bezeichnet, das über eine 5'–5'-Triphosphatbrücke mit dem ersten transkribierten Nukleotid verbunden ist. Die VCE-Aktivität umfasst RNA-Triphosphatase-, Guanylyltransferase- und (Guanin-N7)-Methyltransferase-Funktionen. Das Cap spielt eine entscheidende Rolle bei der Stabilität des Transkripts, der effizienten Initiation der Translation und der Resistenz gegen exonucleolytischen Abbau.
• 2'-O-Methyltransferase: Wandelt Cap 0 in Cap 1 (m⁷GpppNm) um, indem es die Ribose-2'-Hydroxylgruppe des ersten transkribierten Nukleotids methyliert. Cap 1-Strukturen werden von den Immunsystemen des Wirts als "selbst" erkannt, wodurch die angeborenen Immunantworten, die durch Toll-like Rezeptoren (TLRs), RIG-I und MDA5 vermittelt werden, erheblich reduziert werden.

Die enzymatische Capping-Methode ermöglicht eine nahezu quantitative Umwandlung von uncapped RNA in die vollständig gecappte Cap 1-Struktur, was besonders nützlich für empfindliche Anwendungen wie Impfstoffentwicklung und Gentherapien ist.

Abbildung 3. Sequenzielle enzymatische Aktivitäten, die zum RNA-5'-End-Cap führen. (Pal, 2020)

Poly(A)-Tailing

Bei Fehlen eines kodierten Polyadenylierungstrakts innerhalb der Plasmid-DNA muss der 3'-Poly(A)-Schwanz posttranskriptionell enzymatisch hinzugefügt werden.

• Poly(A)-Polymerase (PAP): Katalysiert die template-unabhängige Addition von Adenosinmonophosphaten an das 3'-Hydroxylterminus des RNA-Transkripts. Diese enzymatische Reaktion nutzt typischerweise ATP als Substrat und wird in optimierten Puffersystemen durchgeführt, um Homogenität und angemessene Schwanzlänge sicherzustellen.
• Optimale Poly(A)-Schwanzlänge: Empirische Studien legen nahe, dass ein etwa 100–150 Nukleotid langer Poly(A)-Schwanz den besten Kompromiss zwischen Transkriptstabilität, translationeller Effizienz und Resistenz gegen zytoplasmatischen Abbau bietet. Eine Überlängerung kann die Faltung und Translation des Transkripts beeinträchtigen, und kürzere Schwänze können die Stabilität gefährden.

Die Polyadenylierung ist ein entscheidender Faktor für die mRNA-Halblebensdauer und die Rekrutierung zum ribosomalen Komplex in eukaryotischen Zellen.

DNase-Behandlung

Übrig gebliebene DNA-Vorlagen aus IVT-Reaktionen müssen rigoros entfernt werden, um den regulatorischen Richtlinien zu entsprechen, die Aktivierung des angeborenen Immunsystems zu verhindern und Hintergrund in funktionalen Assays zu eliminieren.

• Turbo DNase (rekombinante RNase-freie DNase I): Hydrolysiert effizient Einzel- und Doppelstrang-DNA unter Bedingungen, die die RNA-Integrität bewahren. Diese Behandlung wird typischerweise nach der IVT und der Polyadenylierung durchgeführt, gefolgt von Wärmeinaktivierung oder Reinigung zur Entfernung des Enzyms.

Die DNase-Behandlung ist nicht nur für therapeutische Anwendungen, sondern auch für analytische Arbeitsabläufe wie RT-qPCR von entscheidender Bedeutung, bei denen DNA-Kontamination die Quantifizierung verfälschen kann.

mRNA-Reinigung

Die Reinigung ist arguably der kritischste Schritt in der Produktion von therapeutischer mRNA. Diese Phase zielt darauf ab, Verunreinigungen wie Proteine, verbleibende DNA, verkürzte Transkripte, Nukleotide, Enzyme und Endotoxine zu entfernen. Eine Vielzahl von Reinigungsstrategien wird eingesetzt, oft in Kombination, um die erforderliche Qualität und die regulatorischen Standards zu erreichen.

Präzipitationsmethoden

Die Präzipitation bleibt eine weit verbreitete primäre Reinigungsmethode aufgrund ihrer Einfachheit, Skalierbarkeit und Kosteneffektivität.

• Lithiumchlorid (LiCl)-Präzipitation: LiCl präzipitiert selektiv lange RNA-Spezies, während die meisten Proteine, kurzen RNA-Fragmente, freie Nukleotide und Salze im Überstand zurückbleiben. Das Standardprotokoll umfasst eine Inkubation bei 4 °C, gefolgt von Hochgeschwindigkeitszentrifugation.
• Ethanol-Präzipitation: Wird typischerweise in Verbindung mit Salzen (z. B. Natriumacetat) verwendet, um RNA effizient aus verdünnten Lösungen zurückzugewinnen. Dieser Schritt ist besonders nützlich für den Pufferaustausch und die Entsalzung vor enzymatischer Verarbeitung oder chromatographischer Reinigung.

Obwohl die Präzipitation keine hochauflösende Trennung bietet, wird sie häufig in mehrstufige Reinigungsprotokolle integriert, um Bulkverunreinigungen zu reduzieren.

Chromatographische Reinigung

Chromatographiebasierte Techniken bieten überlegene Auflösung und Spezifität für die Isolation von vollwertigen, hochreinen mRNA-Transkripten.

• Oligo(dT)-Affinity-Chromatographie: Nutzt die Affinität zwischen Poly(A)-Schwänzen und oligo(dT)-konjugierten Harzen (z. B. Sepharose oder magnetischen Perlen). Dieser Ansatz fängt selektiv polyadenylierte Transkripte ein und entfernt verkürzte RNAs und nicht-polyadenylierte Verunreinigungen. Er ist besonders effektiv zur Reinigung von mRNA aus gesamten IVT-Mischungen.
• Größenausschlusschromatographie (SEC): Trennt Moleküle basierend auf dem hydrodynamischen Radius. SEC kann effektiv kurze Transkripte, degradierte RNA und nicht inkorporierte Nukleotide entfernen, während die native Konformation der vollwertigen mRNA erhalten bleibt.
• Ionenaustauschchromatographie (IEX): Trennt Nukleinsäuren basierend auf der Nettoladung. Anionenaustauschharze (z. B. DEAE oder Q-Sepharose) werden häufig unter Niedrigsalzbedingungen verwendet. Die Feinabstimmung von Salzgradienten ermöglicht die Trennung von gecappten und ungecappten mRNA sowie von vollwertigen und verkürzten Produkten.

Chromatographische Techniken sind besonders nützlich bei der Herstellung von klinisch hochwertiger mRNA, die eine hohe Batch-zu-Batch-Konsistenz erfordert.

Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC)

HPLC ist ein leistungsstarkes analytisches und präparatives Werkzeug in der mRNA-Reinigung, das die Trennung von mRNA-Isoformen, Verunreinigungen und strukturell ähnlichen Spezies ermöglicht.

• Reverse-Phase-HPLC (RP-HPLC): Basierend auf hydrophoben Wechselwirkungen zwischen RNA und der Säulenmatrix. Verwendet typischerweise eine C18-Säule und Ionenaustauschreagenzien (z. B. Triethylammoniumacetat), um die Auflösung zu verbessern. RP-HPLC ist hervorragend geeignet, um modifizierte und unmodifizierte mRNA, verkürzte Spezies und verbleibende enzymatische Proteine zu trennen.
• Hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC): Nützlich zur Unterscheidung zwischen gecappten und ungecappten RNA basierend auf Unterschieden in der Hydrophobizität. HIC wird häufig als Qualitätskontrollwerkzeug oder als sekundärer Reinigungsschritt eingesetzt, um die endgültige Reinheit zu verbessern.

Diese Methoden sind wertvoll in der Qualitätssicherung (QA) und werden häufig in gute Herstellungspraxis (GMP)-Prozesse für mRNA-basierte Therapeutika integriert.

Filtrationsbasierte Methoden

Tangentialflussfiltration (TFF) ist eine skalierbare und effiziente Methode für Pufferaustausch, RNA-Konzentration und Verunreinigungsentfernung. TFF-Systeme nutzen Hohlfasermembranen oder Flachmembranen mit definierten Molekulargewichtsgrenzwerten, um RNA zurückzuhalten, während kleine Moleküle und Salze passieren können.

TFF wird häufig sowohl in den upstream- als auch in den downstream-Verarbeitungsphasen eingesetzt, insbesondere bei der großtechnischen mRNA-Produktion. Es ist mit kontinuierlichen Herstellungsstrategien kompatibel und eignet sich gut für Hochdurchsatzoperationen.

Abbildung 4. Zusammenfassung der Produktion von funktioneller mRNA. (Papaioannou et al., 2023)

Die mRNA-Produktionspipeline ist ein sorgfältig kontrollierter Prozess, der die Vorbereitung der DNA-Vorlage, IVT, Capping, Reinigung und strenge Qualitätskontrolle umfasst. Fortschritte in enzymatischen Modifikationen, chromatographischer Reinigung und analytischen Techniken haben die mRNA-Ausbeute, Stabilität und translationale Effizienz erheblich verbessert. Während sich die regulatorischen Rahmenbedingungen weiterentwickeln und neue Technologien entstehen, wird die mRNA-Herstellung weiterhin verbessert, was breitere therapeutische Anwendungen ermöglicht.

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