Die Messenger-RNA (mRNA) hat sich als vielseitige und leistungsstarke Plattform in der Biotechnologie etabliert und revolutioniert Impfstoffe, therapeutische Proteinabgabe, Genbearbeitung und regenerative Medizin. Da mRNA-basierte Produkte jedoch von Forschungslabors in klinische Anwendungen übergehen, wird die Notwendigkeit einer GMP-konformen Produktion von größter Bedeutung. Die GMP-Prinzipien stellen sicher, dass mRNA-Therapeutika konsistent produziert und kontrolliert werden, gemäß den Qualitätsstandards, die für ihre beabsichtigte Verwendung angemessen sind. Hier stellt Creative Enzymes die kritischen Komponenten, Herausforderungen und regulatorischen Erwartungen im Zusammenhang mit der GMP-mRNA-Produktion vor.

Einführung in GMP in der mRNA-Herstellung

GMP ist ein System, das entwickelt wurde, um Risiken in der pharmazeutischen Produktion zu minimieren, die nicht allein durch Tests des Endprodukts beseitigt werden können. Für mRNA umfasst GMP jeden Aspekt der Herstellung: von der Beschaffung der Rohstoffe und der Sequenzgestaltung bis hin zu Prozesskontrollen und der Endfreigabetests. Die GMP-mRNA-Produktion gewährleistet Produktsicherheit, Identität, Stärke, Reinheit und Qualität (SISPQ).

Der GMP-Rahmen wird von internationalen Vorschriften geleitet, einschließlich derjenigen der U.S. Food and Drug Administration (FDA), der Europäischen Arzneimittel-Agentur (EMA) und des International Council for Harmonization (ICH). Die Einhaltung dieser Richtlinien gewährleistet nicht nur die Sicherheit der Patienten, sondern erleichtert auch die Produktgenehmigungen und den internationalen Marktzugang.

Abbildung 1. Gute Herstellungspraktiken während des gesamten Prozesses.

Regulatorische Landschaft und Richtlinien

Wichtige Regulierungsbehörden

• FDA (USA): Erfordert die Einhaltung von 21 CFR Teile 210 und 211, ICH Q7 und ICH Q10.
• EMA (EU): Entspricht EudraLex Band 4, Anhang 1 (sterile Produkte) und ATMP-Vorschriften.
• WHO: Richtlinien für biologische Produkte (TRS 1011).

mRNA-spezifische Richtlinien

• FDA's CMC-Anforderungen: Fokus auf Plasmidintegrität, In-vitro-Transkription (IVT)-Effizienz und LNP-Charakterisierung.
• EMA's risikobasierter Ansatz: Priorisiert die Kontrolle von dsRNA-Verunreinigungen und Lipid-Excipient-Interaktionen.

Anforderungen an Einrichtungen und Infrastruktur

Cleanroom-Klassifizierungen

Die mRNA-Produktion erfordert kontrollierte Umgebungen, um Kontaminationen zu verhindern. Cleanrooms werden basierend auf den ISO 14644-1 Standards klassifiziert:

• Klasse A/B: Aseptische Verarbeitungszonen.
• Klasse C/D: Hintergrund- und Unterstützungsbereiche.

Ein ordnungsgemäßer Luftstrom, Druckdifferenzen und Umgebungsüberwachungssysteme sind entscheidend, um die Sterilität aufrechtzuerhalten und Kreuzkontaminationen zu vermeiden.

Ausrüstungsqualifizierung

Alle verwendeten Geräte müssen strengen Qualifizierungsprotokollen unterzogen werden:

• Installationsqualifizierung (IQ)
• Betriebsqualifizierung (OQ)
• Leistungsqualifizierung (PQ)

Dies stellt sicher, dass Instrumente wie Fermenter, Zentrifugen, Chromatographiesysteme und IVT-Reaktoren konsistent innerhalb der festgelegten Parameter arbeiten.

Rohmaterialkontrolle

Beschaffung und Rückverfolgbarkeit

Kritische Rohmaterialien umfassen Nukleotide (NTPs), Kappungsreagenzien, Enzyme (z.B. T7 RNA-Polymerase), Plasmidvorlagen und Lösungsmittel. Alle Materialien müssen von GMP-konformen Anbietern mit Analysezertifikaten (CoAs) bezogen werden, und ihre Lieferkette muss rückverfolgbar sein.

Qualitätsmerkmale

Wichtige Parameter umfassen Identität, Reinheit, Endotoxingehalte und Bioburden. Regelmäßige Audits und Materialtests reduzieren die Variabilität und gewährleisten Konsistenz über Chargen hinweg.

Vorbereitung der Vorlage

Produktion von Plasmid-DNA

Plasmidvorlagen, die für die In-vitro-Transkription (IVT) verwendet werden, müssen selbst unter GMP produziert werden. Dies umfasst:

• Hochkopie-Bakterienfermentation (z.B. E. coli)
• Alkalische Lyse und Reinigung (Anionenaustausch oder HIC)
• Endotoxinentfernung auf <10 EU/mg

Linearisation und Reinigung

Die Linearisation mit Restriktionsenzymen gewährleistet ein Durchlaufen der Transkription und minimiert abnormale Nebenprodukte. Die gereinigte lineare DNA wird dann auf Folgendes überprüft:

• Integrität (Gel-Elektrophorese oder Kapillarelektrophorese)
• Rest-RNase- und Endotoxingehalte

In-vitro-Transkription (IVT)

IVT ist der Kern der mRNA-Synthese und muss sorgfältig kontrolliert werden. Der Prozess umfasst:

• Reaktionsaufbau: Lineare DNA, NTPs, T7 RNA-Polymerase, RNase-Inhibitoren und Kappungsreagenzien werden gemischt.
• Temperaturkontrolle: Typischerweise bei 37°C durchgeführt.
• Zeitüberwachung: Gewährleistet optimalen Ertrag, ohne die Qualität zu beeinträchtigen.

Co-Transkriptionale vs. Post-Transkriptionale Kappung

• Co-transkriptional: Verwendet Kappenanaloga wie ARCA.
• Post-transkriptional: Verwendet Kappungsenzyme wie das Vaccinia-Kappungsenzym (VCE), gefolgt von 2'-O-Methyltransferase.

Jede Methode muss auf Kappungseffizienz und Auswirkungen auf die Translation validiert werden.

mRNA-Reinigung und Qualitätssicherung

Entfernung von Verunreinigungen

Die Reinigung muss Folgendes eliminieren:

• Template-DNA: Behandelt mit Turbo DNase und über Chromatographie entfernt.
• dsRNA-Nebenprodukte: Können die angeborene Immunität aktivieren; entfernt durch cellulosebasierte Filtration oder HPLC.
• Proteine und Salze: Durch tangentiale Flussfiltration (TFF) und Ethanolpräzipitation eliminiert.

Chromatographische Techniken

• Oligo(dT)-Affinity-Chromatographie: Fängt poly(A)-schwanzige mRNA ein.
• Ionen-Austausch-Chromatographie (IEX): Trennt geladene Verunreinigungen.
• Größenexklusionschromatographie (SEC): Entfernt verkürzte Transkripte.

Analytische Charakterisierung

Identitäts- und Reinheitstests

• UV-Spektroskopie: A260/A280- und A260/A230-Verhältnisse zur Reinheit.
• Kapillarelektrophorese: Integrität und Größenverteilung.
• HPLC: Trennung und Quantifizierung von vollwertiger und fragmentierter RNA.

Verunreinigungsanalyse

• dsRNA-Gehalt: Gemessen durch Dot Blot oder ELISA.
• Rest-DNA/Protein: Mit qPCR und BCA jeweils analysiert.
• Endotoxine: Quantifiziert durch Limulus-Amebocyte-Lysat (LAL)-Test.

Funktionale Tests

• qRT-PCR: Bestätigt die Sequenzidentität.
• In-vitro-Translation: Bewertet die Translationseffizienz in zellbasierten Systemen.

Stabilität und Lagerung

Stabilitätstests

Beschleunigte und Echtzeit-Stabilitätsstudien bewerten:

• Thermische Zersetzung
• Frost-Tau-Robustheit
• Photostabilität

Die Ergebnisse informieren über empfohlene Lagerbedingungen und Haltbarkeit.

Lagerung und Transport

• Temperatur: Typischerweise -80°C oder flüssiger Stickstoff für die Langzeitlagerung.
• Behälter: RNase-freie Vials, Oberflächen mit geringer Bindung.
• Versand: Isolierte, überwachte Kühlkettenlogistik.

Dokumentation und Aufzeichnung

Chargenaufzeichnungen

• Master Production Record (MPR): Genehmigte Vorlage für jedes Produkt.
• Elektronische Chargenaufzeichnungen (EBR): Gewährleisten Datenintegrität (ALCOA+-Prinzipien).

Rückverfolgbarkeit

• Einzigartige Chargennummern: Verfolgen Materialien vom Empfang bis zum Endprodukt.
• Aufbewahrungsproben: Für 1 Jahr nach Ablauf aufbewahren (FDA 21 CFR 211.170).

Die GMP-mRNA-Produktion ist ein multidisziplinäres Unterfangen, das Fachwissen in Molekularbiologie, Ingenieurwesen, Qualitätssicherung und regulatorischen Angelegenheiten erfordert. Durch die Implementierung robuster GMP-konformer Praktiken können Hersteller sicherstellen, dass mRNA-Produkte die höchsten Standards in Bezug auf Qualität, Sicherheit und Wirksamkeit erfüllen. Mit dem Fortschritt des Feldes werden kontinuierliche Innovation und regulatorische Harmonisierung entscheidend sein, um das öffentliche Vertrauen aufrechtzuerhalten und das volle therapeutische Potenzial der mRNA-Technologien zu erschließen.

Creative Enzymes bietet eine Reihe von Enzymen für die mRNA-Produktion, einschließlich Enzymen, die den GMP-Standards entsprechen. Für weitere Informationen kontaktieren Sie uns bitte speziell entwickelt und hergestellt, um den GMP-Anforderungen gerecht zu werden. Für weitere Informationen kontaktieren Sie bitte uns.