Messenger-RNA (mRNA) hat sich als vielseitige und leistungsstarke Plattform in der Biotechnologie etabliert und revolutioniert Impfstoffe, die therapeutische Proteinabgabe, Gen-Editierung und die regenerative Medizin. Mit dem Übergang mRNA-basierter Produkte von Forschungslaboren zu klinischen Anwendungen wird die Notwendigkeit einer Produktion gemäß den Grundsätzen der Guten Herstellungspraxis (GMP) immer wichtiger. GMP-Prinzipien stellen sicher, dass mRNA-Therapeutika konsistent hergestellt und kontrolliert werden, entsprechend den Qualitätsstandards, die für ihren vorgesehenen Verwendungszweck angemessen sind. Hier stellt Creative Enzymes die entscheidenden Komponenten, Herausforderungen und regulatorischen Erwartungen im Zusammenhang mit der GMP-mRNA-Produktion vor.

Einführung in GMP in der mRNA-Herstellung

GMP ist ein System, das darauf ausgelegt ist, Risiken in der pharmazeutischen Produktion zu minimieren, die nicht allein durch die Prüfung des Endprodukts ausgeschlossen werden können. Für mRNA umfasst GMP jeden Aspekt der Herstellung: von der Beschaffung der Rohstoffe und dem Sequenzdesign bis hin zu In-Prozess-Kontrollen und abschließenden Freigabetests. Die GMP-mRNA-Produktion gewährleistet Produktsicherheit, Identität, Stärke, Reinheit und Qualität (SISPQ).

Der GMP-Rahmen wird durch internationale Vorschriften geleitet, darunter die der U.S. Food and Drug Administration (FDA), der Europäischen Arzneimittel-Agentur (EMA) und des International Council for Harmonization (ICH). Die Einhaltung dieser Richtlinien gewährleistet nicht nur die Patientensicherheit, sondern erleichtert auch die Produktzulassung und den Zugang zu internationalen Märkten.

Abbildung 1. Gute Herstellungspraxis während des gesamten Prozesses.

Regulatorische Landschaft und Richtlinien

Wichtige Regulierungsbehörden

• FDA (USA): Erfordert die Einhaltung von 21 CFR Parts 210 und 211, ICH Q7 und ICH Q10.
• EMA (EU): Entspricht EudraLex Volume 4, Anhang 1 (sterile Produkte) und ATMP-Vorschriften.
• WHO: Richtlinien für biologische Produkte (TRS 1011).

mRNA-spezifische Leitlinien

• FDA's CMC-Anforderungen: Fokus auf Plasmid-Integrität, Effizienz der in vitro Transkription (IVT) und LNP-Charakterisierung.
• EMA's risikobasierter Ansatz: Priorisiert die Kontrolle von dsRNA-Verunreinigungen und Lipid-Hilfsstoff-Interaktionen.

Anforderungen an Anlagen und Infrastruktur

Reinraumklassifizierungen

Die mRNA-Produktion erfordert kontrollierte Umgebungen, um Kontaminationen zu verhindern. Reinräume werden gemäß ISO 14644-1 klassifiziert:

• Klasse A/B: Bereiche für aseptische Verarbeitung.
• Klasse C/D: Hintergrund- und Unterstützungsbereiche.

Ein ordnungsgemäßer Luftstrom, Druckdifferenzen und Umgebungsüberwachungssysteme sind unerlässlich, um Sterilität zu gewährleisten und Kreuzkontaminationen zu vermeiden.

Qualifizierung der Ausrüstung

Alle verwendeten Geräte müssen strenge Qualifizierungsprotokolle durchlaufen:

• Installationsqualifizierung (IQ)
• Betriebsqualifizierung (OQ)
• Leistungsqualifizierung (PQ)

Dies stellt sicher, dass Instrumente wie Fermenter, Zentrifugen, Chromatographiesysteme und IVT-Reaktoren konsistent innerhalb festgelegter Parameter arbeiten.

Rohstoffkontrolle

Beschaffung und Rückverfolgbarkeit

Kritische Rohstoffe umfassen Nukleotide (NTPs), Capping-Reagenzien, Enzyme (z. B. T7-RNA-Polymerase), Plasmid-Templates und Lösungsmittel. Alle Materialien müssen von GMP-konformen Lieferanten mit Analysenzertifikaten (CoAs) bezogen werden, und ihre Lieferkette muss rückverfolgbar sein.

Qualitätsattribute

Zentrale Parameter sind Identität, Reinheit, Endotoxinspiegel und Keimbelastung. Regelmäßige Audits und Materialprüfungen verringern die Variabilität und gewährleisten die Konsistenz zwischen den Chargen.

Template-Vorbereitung

Plasmid-DNA-Produktion

Plasmid-Templates, die für die in vitro Transkription (IVT) verwendet werden, müssen selbst unter GMP-Bedingungen hergestellt werden. Dies umfasst:

• Hochdichte bakterielle Fermentation (z. B. E. coli)
• Alkalische Lyse und Reinigung (Anionenaustausch oder HIC)
• Endotoxinentfernung auf <10 EU/mg

Linearisierung und Reinigung

Die Linearisierung mit Restriktionsenzymen gewährleistet Run-off-Transkription und minimiert abweichende Nebenprodukte. Gereinigte lineare DNA wird dann bewertet hinsichtlich:

• Integrität (Gelelektrophorese oder Kapillarelektrophorese)
• Restliche RNase- und Endotoxinspiegel

In vitro Transkription (IVT)

IVT ist der Kern der mRNA-Synthese und muss sorgfältig kontrolliert werden. Der Prozess umfasst:

• Reaktionsansatz: Lineare DNA, NTPs, T7-RNA-Polymerase, RNase-Inhibitoren und Capping-Agens werden gemischt.
• Temperaturkontrolle: Typischerweise bei 37°C durchgeführt.
• Zeitüberwachung: Gewährleistet optimalen Ertrag ohne Qualitätseinbußen.

Co-transkriptionelles vs. post-transkriptionelles Capping

• Co-transkriptionell: Verwendet Cap-Analoga wie ARCA.
• Post-transkriptionell: Setzt Capping-Enzyme wie Vaccinia-Capping-Enzym (VCE) gefolgt von 2'-O-Methyltransferase ein.

Jede Methode muss hinsichtlich Capping-Effizienz und Einfluss auf die Translation validiert werden.

mRNA-Reinigung und Qualitätssicherung

Entfernung von Verunreinigungen

Die Reinigung muss eliminieren:

• Template-DNA: Behandelt mit Turbo DNase und durch Chromatographie entfernt.
• dsRNA-Nebenprodukte: Können die angeborene Immunität aktivieren; Entfernung durch zellulosebasierte Filtration oder HPLC.
• Proteine und Salze: Entfernt durch tangentiale Flussfiltration (TFF) und Ethanolfällung.

Chromatographische Techniken

• Oligo(dT)-Affinitätschromatographie: Fängt poly(A)-versehene mRNA ein.
• Ionenaustauschchromatographie (IEX): Trennt geladene Verunreinigungen.
• Größenausschlusschromatographie (SEC): Entfernt verkürzte Transkripte.

Analytische Charakterisierung

Identitäts- und Reinheitstests

• UV-Spektroskopie: A260/A280- und A260/A230-Verhältnisse zur Reinheitsbestimmung.
• Kapillarelektrophorese: Integrität und Größenverteilung.
• HPLC: Trennung und Quantifizierung von voll- und fragmentierter RNA.

Verunreinigungsanalyse

• dsRNA-Gehalt: Gemessen mittels Dot-Blot oder ELISA.
• Rest-DNA/Protein: Nachweis mittels qPCR bzw. BCA.
• Endotoxine: Quantifizierung mittels Limulus-Amoebozyten-Lysat (LAL)-Test.

Funktionelle Tests

• qRT-PCR: Bestätigt die Sequenzidentität.
• In vitro Translation: Bewertet die Translationseffizienz in zellbasierten Systemen.

Stabilität und Lagerung

Stabilitätstests

Beschleunigte und Echtzeit-Stabilitätsstudien bewerten:

• Thermische Zersetzung
• Robustheit gegenüber Einfrieren und Auftauen
• Lichtstabilität

Die Ergebnisse informieren über empfohlene Lagerbedingungen und Haltbarkeit.

Lagerung und Transport

• Temperatur: Typischerweise -80°C oder flüssiger Stickstoff für die Langzeitlagerung.
• Behälter: RNase-freie Vials, Oberflächen mit geringer Bindung.
• Versand: Isolierte, überwachte Kühlkettenlogistik.

Dokumentation und Aufzeichnungen

Chargendokumentation

• Master Production Record (MPR): Genehmigte Vorlage für jedes Produkt.
• Electronic Batch Records (EBR): Gewährleisten Datenintegrität (ALCOA+-Prinzipien).

Rückverfolgbarkeit

• Eindeutige Chargennummern: Verfolgen Materialien vom Eingang bis zum Endprodukt.
• Rückstellmuster: Lagerung für 1 Jahr nach Ablauf (FDA 21 CFR 211.170).

Die GMP-mRNA-Produktion ist ein multidisziplinäres Unterfangen, das Fachwissen in Molekularbiologie, Technik, Qualitätssicherung und regulatorischen Angelegenheiten erfordert. Durch die Umsetzung robuster, GMP-konformer Praktiken können Hersteller sicherstellen, dass mRNA-Produkte den höchsten Standards in Bezug auf Qualität, Sicherheit und Wirksamkeit entsprechen. Mit der Weiterentwicklung des Feldes werden kontinuierliche Innovation und regulatorische Harmonisierung entscheidend sein, um das Vertrauen der Öffentlichkeit zu erhalten und das volle therapeutische Potenzial der mRNA-Technologien auszuschöpfen.

Creative Enzymes bietet eine Reihe von Enzymen für die mRNA-Produktion an, darunter Enzyme, die den GMP-Standards entsprechen. Für weitere Informationen kontaktieren Sie uns bitte – speziell entwickelt und hergestellt, um die GMP-Anforderungen zu erfüllen. Für weitere Informationen kontaktieren Sie uns.