Die Produktion von Messenger-RNA (mRNA), insbesondere die in vitro-Synthese, ist ein Grundpfeiler der modernen Biotechnologie und spielt eine zentrale Rolle in Anwendungen, die von der Impfstoffentwicklung bis zu Protein-Ersatztherapien reichen. Der Prozess umfasst das koordinierte Wirken mehrerer Enzyme, die eine effiziente, hochpräzise Synthese, Reifung und Reinigung von mRNA gewährleisten. Dieser Artikel bietet einen umfassenden Überblick über die wesentlichen Enzyme, die während der in vitro mRNA-Produktion verwendet werden, und beschreibt ihre spezifischen Funktionen und ihre Relevanz in jeder Phase des Workflows.

Creative Enzymes bietet Enzyme für die mRNA-Produktion an, die für jede Phase dieses Prozesses entscheidend sind, von der Plasmidlinearisation bis zur mRNA-Capping und Polyadenylierung.

Überblick über die mRNA-Produktion

mRNA dient als Vermittler zwischen der genetischen Information, die in DNA kodiert ist, und der Synthese von Proteinen. Die in vitro-Transkription (IVT) von mRNA hat sich als kritische Plattform für die therapeutische Entwicklung etabliert. Die Erzeugung von funktioneller und translational kompetenter mRNA erfordert nicht nur die Synthese des RNA-Strangs, sondern auch posttranskriptionale Modifikationen wie 5'-Capping, 3'-Polyadenylierung und rigorose Reinigung. Diese Schritte werden von einer Reihe hochspezialisierter Enzyme vermittelt, die jeweils unterschiedliche mechanistische Rollen spielen, die zur Integrität und translationalen Effizienz des endgültigen mRNA-Produkts beitragen.

Abbildung 1. (a) Überblick über wesentliche strukturelle Elemente der in vitro transkribierten (IVT) mRNA. (b) Beginn der kappeabhängigen Translation. Der Beginn der kappeabhängigen Translation wird durch die Bindung des eukaryotischen Translation Initiationsfaktors 4E (eIF4E) an die 5'-Kappe eingeleitet. Das an die 5'-Kappe gebundene eIF4E interagiert mit einer Vielzahl von Translation Initiationsfaktoren, und das Poly-A-bindende Protein (PABP) wird ebenfalls in den Translation Initiationskomplex integriert, wodurch die mRNA zirkularisiert wird. Während dieses Initiationsprozesses wird das 40S-Ribosom zum Initiationskomplex rekrutiert, das anschließend den Startcodon für den Beginn der Translation scannt. Darüber hinaus kann das 40S-Ribosom auch in das IRES im 5' UTR rekrutiert werden, was die kappeunabhängige Translation einleitet. (Kwon et al., 2018)

Vorbereitung der DNA-Vorlage in vitro

Bevor die Transkription beginnt, ist eine hochwertige lineare DNA-Vorlage erforderlich, die das interessierende Gen unter der Kontrolle eines Promotors (in der Regel T7, SP6 oder T3) enthält. Die an dieser Phase beteiligten Enzyme umfassen:

Einschränkungsendonukleasen

Einschränkungsenzyme wie EcoRI, BamHI und BsaI werden häufig verwendet, um plasmidische DNA zu linearisieren. Die Linearisation ist entscheidend, um ein Durchlesen der Transkription zu verhindern und definierte mRNA-Enden sicherzustellen.

DNA-Polymerasen

Hochpräzise DNA-Polymerasen wie Phusion oder Q5 werden während der PCR-Amplifikation eingesetzt, um die Transkriptionsvorlage zu erstellen oder zu amplifizieren. Diese Enzyme bieten eine Korrekturlesefunktion, um Mutationen zu reduzieren, die die Funktion oder Stabilität der mRNA beeinträchtigen könnten.

Enzymatische Komponenten des mRNA-Produktion Prozesses in vitro

RNA-Polymerase: Herkunft und Regulation

In vitro-Systeme nutzen überwiegend von Bakteriophagen abgeleitete RNA-Polymerasen wie T7, SP6 oder T3 RNA-Polymerase. Diese Enzyme sind einheitliche, promoter-spezifische und hochprozessive Enzyme. Sie benötigen keine Hilfsproteine oder Chromatin-Remodellierung und arbeiten unter definierten Pufferbedingungen, was eine schnelle und effiziente Transkription von plasmidischen oder linearen DNA-Vorlagen mit dem entsprechenden Phagenpromotor ermöglicht.

5'-Capping-Mechanismen

In vitro-Capping kann entweder erreicht werden:

• Posttranskriptionell, unter Verwendung von Vaccinia-Virus-Capping-Enzym und 2'-O-Methyltransferase.
• Ko-transkriptionell, durch die Einbeziehung von synthetischen Kappenanaloga wie Anti-Reverse Cap Analog (ARCA) direkt in die Transkriptionsreaktion.

Diese Methoden sind darauf ausgelegt, natürliche Capping-Strukturen zu imitieren und die Aktivierung des angeborenen Immunsystems zu reduzieren, obwohl sie den regulatorischen Kontext des endogenen Capping-Komplexes nicht aufweisen.

3'-Polyadenylierung

In vitro wird die Polyadenylierung entweder:

• Enzymatisch unter Verwendung von E. coli oder Hefe Poly(A)-Polymerase durchgeführt, die Adeninreste am 3'-Ende ohne Vorlage hinzufügt.
• Vorlagenkodiert, indem eine Poly(A)-Schwanzsequenz direkt in die DNA-Vorlage integriert wird, die für die Transkription verwendet wird.

Der enzymatische Ansatz bietet mehr Kontrolle über die Schwanzlänge, wird jedoch nicht von RNA-bindenden Proteinen oder Schnittstellen wie in vivo reguliert.

Abbildung 2. Grundlegender Workflow für die mRNA-Synthese. Die in vitro-Synthese von mRNA beginnt mit der Vorbereitung der DNA-Vorlage, die das interessierende Gen enthält (dargestellt in orange), das plasmidische DNA, ein PCR-Produkt oder eine cDNA-Vorlage sein kann. Diese DNA-Vorlagen werden für die in vitro-Transkription von mRNA unter Verwendung einer RNA-Polymerase verwendet, gefolgt von mRNA-Capping im 5' untranslatierten Bereich, der Hinzufügung eines Poly(A)-Schwanzes im 3' untranslatierten Bereich (optional in Fällen, in denen ein Poly(A) in der DNA-Vorlage enthalten ist) und der Reinigung der endgültigen mRNA. UTR, untranslatierte Regionen. (Campillo-Davo et al., 2021)

RNA-Verarbeitungsenzyme und -komplexe

Die in vitro mRNA-Produktion umgeht die nukleären RNA-Verarbeitungswege. Introns werden typischerweise aus synthetischen mRNA-Konstrukten weggelassen, und Spleißen ist nicht erforderlich. Es sind keine RNA-Bearbeitungs- oder nukleären Exportmechanismen beteiligt. Stattdessen werden chemische Modifikationen und optimierte UTRs (untranslatierte Regionen) während des Designs integriert, um die translationale Effizienz und Stabilität im Zytoplasma zu verbessern.

Nuklease- und Kontaminantenmanagement

Um eine Degradation während der in vitro-Synthese zu verhindern, werden RNase-Inhibitoren während der Reaktions- und Reinigungsprozesse hinzugefügt. Darüber hinaus wird DNase I verwendet, um die DNA-Vorlage nach der Transkription abzubauen, um eine reine mRNA-Präparation ohne Kontamination durch die DNA-Vorlage sicherzustellen.

Zusammenfassung der enzymatischen Rollen

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