Die Herstellung von Messenger-RNA (mRNA), insbesondere die in vitro-Synthese, ist ein Grundpfeiler der modernen Biotechnologie und spielt eine zentrale Rolle bei Anwendungen, die von der Impfstoffentwicklung bis hin zu Protein-Ersatztherapien reichen. Der Prozess umfasst das koordinierte Zusammenspiel mehrerer Enzyme, die eine effiziente, hochfidele Synthese, Reifung und Reinigung der mRNA gewährleisten. Dieser Artikel bietet einen umfassenden Überblick über die essenziellen Enzyme, die während der in vitro-mRNA-Produktion eingesetzt werden, und beschreibt deren spezifische Funktionen und Bedeutung in jeder Phase des Workflows.

Creative Enzymes bietet Enzyme für die mRNA-Produktion an, die für jede Stufe dieses Prozesses entscheidend sind – von der Plasmid-Linearisation bis zur mRNA-Kappung und Polyadenylierung.

Überblick über die mRNA-Produktion

mRNA dient als Vermittler zwischen der in der DNA kodierten genetischen Information und der Proteinsynthese. Die in vitro-Transkription (IVT) von mRNA hat sich als entscheidende Plattform für die Entwicklung von Therapeutika etabliert. Die Erzeugung funktioneller und translationskompetenter mRNA erfordert nicht nur die Synthese des RNA-Strangs, sondern auch posttranskriptionale Modifikationen wie 5'-Kappung, 3'-Polyadenylierung und eine gründliche Reinigung. Diese Schritte werden von einer Reihe hochspezialisierter Enzyme vermittelt, die jeweils unterschiedliche mechanistische Rollen einnehmen und zur Integrität und Translationseffizienz des finalen mRNA-Produkts beitragen.

Abbildung 1. (a) Überblick über die wesentlichen Strukturelemente von in vitro transkribierter (IVT) mRNA. (b) Initiation der cap-abhängigen Translation. Die Initiation der cap-abhängigen Translation beginnt mit der Bindung des eukaryotischen Translationsinitiationsfaktors 4E (eIF4E) an die 5'-Kappe. Das an die 5'-Kappe gebundene eIF4E interagiert mit verschiedenen Translationsinitiationsfaktoren, und das Poly-A-Bindeprotein (PABP) wird ebenfalls in den Initiationskomplex eingebaut, wodurch die mRNA zirkularisiert wird. Während dieses Initiationsprozesses wird die 40S-Ribosomenuntereinheit an den Initiationskomplex rekrutiert und scannt anschließend das Startcodon zur Einleitung der Translation. Darüber hinaus kann die 40S-Ribosomenuntereinheit auch an das IRES im 5'-UTR rekrutiert werden, wodurch eine cap-unabhängige Translation initiiert wird. (Kwon et al., 2018)

DNA-Template-Vorbereitung in vitro

Bevor die Transkription beginnt, wird ein hochwertiges lineares DNA-Template benötigt, das das gewünschte Gen unter der Kontrolle eines Promotors (meist T7, SP6 oder T3) enthält. Die in dieser Phase eingesetzten Enzyme umfassen:

Restriktionsendonukleasen

Restriktionsenzyme wie EcoRI, BamHI und BsaI werden häufig zur Linearisation von Plasmid-DNA verwendet. Die Linearisation ist entscheidend, um eine Durchlauftranskription zu verhindern und definierte mRNA-Enden zu gewährleisten.

DNA-Polymerasen

Hochfidele DNA-Polymerasen wie Phusion oder Q5 werden während der PCR-Amplifikation eingesetzt, um das Transkriptionstemplate zu erzeugen oder zu vervielfältigen. Diese Enzyme verfügen über eine Korrekturleseaktivität, um Mutationen zu reduzieren, die die Funktion oder Stabilität der mRNA beeinträchtigen könnten.

Enzymatische Komponenten des mRNA-Produktionsprozesses in vitro

RNA-Polymerase: Herkunft und Regulation

In vitro-Systeme nutzen überwiegend von Bakteriophagen abgeleitete RNA-Polymerasen wie T7-, SP6- oder T3-RNA-Polymerase. Diese Enzyme sind einzelsträngig, promotorenspezifisch und hochprozessiv. Sie benötigen keine Hilfsproteine oder Chromatin-Remodellierung und arbeiten unter definierten Pufferbedingungen, was eine schnelle und effiziente Transkription von Plasmid- oder linearer DNA mit dem entsprechenden Phagenpromotor ermöglicht.

5'-Kappungsmechanismen

In vitro kann die Kappung entweder erfolgen:

• Posttranskriptional, unter Verwendung der Vaccinia-Virus-Kappungsenzym und 2'-O-Methyltransferase.
• Kotranskriptional, durch Einbau synthetischer Kappungsanaloga wie Anti-Reverse Cap Analog (ARCA) direkt in die Transkriptionsreaktion.

Diese Methoden sind darauf ausgelegt, natürliche Kappungsstrukturen zu imitieren und die angeborene Immunaktivierung zu reduzieren, auch wenn sie den regulatorischen Kontext des endogenen Kappungskomplexes nicht aufweisen.

3'-Polyadenylierung

In vitro wird die Polyadenylierung entweder erreicht:

• Enzymatisch mit E. coli- oder Hefe-Poly(A)-Polymerase, die Adeninreste ohne Template an das 3'-Ende anhängt.
• Template-kodiert, indem eine Poly(A)-Schwanz-Sequenz direkt in das für die Transkription verwendete DNA-Template eingebaut wird.

Der enzymatische Ansatz bietet mehr Kontrolle über die Schwanzlänge, ist jedoch nicht wie in vivo durch RNA-bindende Proteine oder Spaltstellen reguliert.

Abbildung 2. Grundlegender Workflow für die mRNA-Synthese. Die in vitro-Synthese von mRNA beginnt mit der Herstellung des DNA-Templates, das das gewünschte Gen enthält (dargestellt in orange). Dies kann linearisierte Plasmid-DNA, ein PCR-Produkt oder ein cDNA-Template sein. Diese DNA-Templates werden für die in vitro-Transkription der mRNA mit einer RNA-Polymerase verwendet, gefolgt von der mRNA-Kappung am 5'-untranslatierten Bereich, dem Anhängen eines Poly(A)-Schwanzes am 3'-untranslatierten Bereich (optional, wenn ein Poly(A) bereits im DNA-Template enthalten ist) und der Reinigung der finalen mRNA. UTR, untranslatierte Bereiche. (Campillo-Davo et al., 2021)

RNA-Prozessierungsenzyme und -Komplexe

Die in vitro-mRNA-Produktion umgeht nukleäre RNA-Prozessierungswege. Introns werden in synthetischen mRNA-Konstrukten typischerweise weggelassen, und Spleißen ist nicht erforderlich. Es sind keine RNA-Editierung oder nukleären Exportmechanismen beteiligt. Stattdessen werden chemische Modifikationen und optimierte UTRs (untranslatierte Bereiche) bereits im Design integriert, um die Translationseffizienz und Stabilität im Zytoplasma zu erhöhen.

Nuklease- und Kontaminationsmanagement

Um einen Abbau während der in vitro-Synthese zu verhindern, werden RNase-Inhibitoren während der gesamten Reaktion und Reinigungsprozesse zugesetzt. Zusätzlich wird DNase I verwendet, um das DNA-Template nach der Transkription abzubauen und so eine reine mRNA-Präparation ohne DNA-Kontamination zu gewährleisten.

Zusammenfassung der enzymatischen Rollen

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