LAP

Leucyl-Aminopeptidasen (EC 3.4.11.1), auch als Leucin-Aminopeptidase, LAPs, leucyl Peptidase, Leucinamid-Aminopeptidase usw. bezeichnet, sind prototypische Dizink-Peptidasen, die bevorzugt die Hydrolyse von Leucin-Resten am N-Terminus von Peptiden und Proteinen katalysieren, während auch andere N-terminale Reste aufgrund der breiten Spezifität gleichzeitig gespalten werden können. LAPs sind ubiquitär in Tieren, Pflanzen und prokaryotischen Zellen vorhanden und haben unterschiedliche gewebespezifische physiologische Rollen bei der Verarbeitung oder dem Abbau von Peptiden. LAPs, einschließlich menschlicher LAP, boviner Linsen-LAP, porziner LAP, der solanaceous-spezifischen sauren LAP (LAP-A) in Tomaten (Solanum lycopersicum) und Escherichia coli LAP (auch bekannt als PepA oder XerB), wurden identifiziert.

Molekulare Struktur

Es wurde festgestellt, dass die aktiven Stellen in PepA und boviner Linsen-LAP isostrukturell sind. Die Biochemie von PepA, boviner Linsen-LAP und LAP-A ist ebenfalls extrem ähnlich, und die LAPs aus diesen drei Spezies spalten bevorzugt N-terminale Leucin-, Arginin- und Methioninreste. Alle diese Enzyme gehören zu den Metallopeptidasen, die zweivalenten Metallkationen für ihre enzymatische Aktivität benötigen und in Anwesenheit von Mn²⁺, Mg²⁺ und Zn²⁺ aktiv sind. Diese Enzyme zeigen auch eine optimale Aktivität bei hohem pH und Temperatur. Bei einem pH von 8 wird die höchste enzymatische Aktivität bei 60 °C beobachtet. Diese LAPs könnten auch Hexamere in vivo bilden. Sechs 55kDa enzymatisch inaktive LAP-A-Protomer haben sich als zusammenkommend erwiesen, um das 353kDa bioaktive LAP-A-Hexamere zu bilden. Strukturen sowohl des bovinen Linsen-LAP-Protomers als auch des konstruierten biologisch aktiven Hexamers sind in der Protein Data Bank (PDB ID: 2J9A) zu finden.

Mechanismen

In einem vorgeschlagenen Mechanismus ist das Bicarbonat-Anion an eine Arginin-Seitenkette (Arg-356 in PepA und Arg-336 in LAP) gebunden und befindet sich sehr nahe an zwei katalytischen Zinkionen. Es wird erwartet, dass das Bicarbonat-Anion als allgemeine Base fungiert, die ein Proton vom zinkbrückenden Wasser-Nukleophil akzeptiert und das Proton an die abgehende Gruppe weiterleitet. Daher ist die Rolle des Bicarbonat-Ions als allgemeine Base in PepA und LAP gleichbedeutend mit der katalytischen Funktion von Carboxylat-Seitenketten in den vermuteten Mechanismen anderer Dizink- oder Monozink-Peptidasen. Darüber hinaus stehen die beiden Zinkionen in Zusammenhang mit der Deprotonierung des Nukleophils zusammen mit Lys-282, der Polarisation der Substratcarbonylgruppe und der Stabilisierung des Übergangszustands. Der Bindungsmodus von Übergangszustandsanaloga-Inhibitoren an LAP, der eine symmetrische Brücke der beiden Zinkionen durch eines der gem-Diol-Sauerstoffe zeigt, wird als von dem angreifenden Nukleophil abgeleitet angesehen, was im Gegensatz zur Möglichkeit steht, dass das Wasser-Nukleophil eine terminale Koordination vor dem nukleophilen Angriff erhält. Die Bindung des Nukleophils an zwei Metallionen wird als schädlich für seine Nukleophilität eingeschätzt. Darüber hinaus werden der Typ und die Ladung der koordinierenden Liganden sowie die dielektrische Konstante und das elektrochemische Potential der Proteinumgebung ebenfalls einen Einfluss auf den pKa und die Nukleophilität von Wasser haben.

Abbildung 1. Katalytische Mechanismen von PepA und LAP. (Sträter N; et al. 1999)

Biologische Funktionen

LAPs werden oft als Enzyme für die Zellwartung mit kritischen Rollen im Umsatz von Peptiden anerkannt. LAPs gehören zu den Mitgliedern der Peptidase-Familien M1 oder M17. Bei Säugetieren tragen die M17- und M1-Enzyme mit LAP-Aktivität zum Prozess der Peptide für die MHC I-Antigenpräsentation, die Behandlung von bioaktiven Peptiden (Oxytocin, Vasopressin, Enkephaline) und dem Vesikeltransport zur Plasmamembran bei. Bei Mikroben spielen die LAPs der M17-Familie eine Rolle bei der Proteolyse und haben die Fähigkeit, mit DNA zu binden, was es LAPs ermöglicht, als transkriptionale Repressoren zu fungieren, um die Biosynthese von Pyrimidinen, Alginat und Cholera-Toxin zu steuern sowie standortspezifische Rekombinationsevents in Plasmiden und Phagen zu regulieren. LAPs sind auch an der Abwehr, dem Membrantransport von Auxinrezeptoren und der Meiose beteiligt. LAP könnte auf die Peptidverdauung und die Leucinfreisetzung hinweisen und die Aminosäureaufnahme im Dünndarm darstellen. Abgesehen davon, dass es ein Hauskeeping-Gen ist, das für den Proteinumsatz notwendig ist, wurde LAP-A auch eine regulatorische Rolle in der Immunantwort in Tomaten zugeordnet. LAP-A als Produkt des Oktadecanoid-Weges in einigen solanaceous Pflanzen hat eine regulatorische Rolle in der späten Wundreaktion von Tomaten gezeigt und ist die erste pflanzliche Aminopeptidase, die eine regulatorische Funktion im Signaltransduktionsweg ausübt. LAP kann auch in einer Vielzahl von marinen Organismen exprimiert werden, um mit der osmotischen Bedrohung durch hohe Salinität umzugehen, wobei LAP mit der Katalyse von Proteinen beginnt, um Aminosäuren in die Zelle freizusetzen, um die hohen Ionenkonzentrationen in der externen Umgebung auszugleichen.

Referenz