LAP

Leucyl-Aminopeptidasen (EC 3.4.11.1), auch als Leucin-Aminopeptidase, LAPs, Leucylpeptidase, Leucinamid-Aminopeptidase usw. bezeichnet, sind prototypische Di-Zink-Peptidasen, die bevorzugt die Hydrolyse von Leucinresten am N‑Terminus von Peptiden und Proteinen katalysieren; aufgrund ihrer breiten Substratspezifität können jedoch auch andere N‑terminale Reste abgespalten werden. LAPs kommen ubiquitär in Tieren, Pflanzen und prokaryotischen Zellen vor und erfüllen unterschiedliche gewebespezifische physiologische Funktionen bei der Prozessierung oder dem Abbau von Peptiden. Identifiziert wurden u. a. LAPs einschließlich der humanen LAP, der LAP aus der Rinderlinse, der porzinen LAP, der solanaceenspezifischen sauren LAP (LAP‑A) in Tomate (Solanum lycopersicum) sowie der Escherichia coli-LAP (auch als PepA oder XerB bekannt).

Molekulare Struktur

Es wurde festgestellt, dass die aktiven Zentren in PepA und der LAP aus der Rinderlinse isostrukturell sind. Auch die Biochemie von PepA, der LAP aus der Rinderlinse und LAP‑A ist äußerst ähnlich, und die LAPs dieser drei Spezies spalten bevorzugt N‑terminale Leucin-, Arginin- und Methioninreste. Alle diese Enzyme gehören zu den Metallopeptidasen, deren enzymatische Aktivität die Anwesenheit zweiwertiger Metallkationen erfordert, und sie sind in Gegenwart von Mn²⁺, Mg²⁺ und Zn²⁺ aktiv. Zudem wurde gezeigt, dass diese Enzyme bei hohem pH-Wert und erhöhter Temperatur eine optimale Aktivität aufweisen. Bei einem pH-Wert von 8 wird die höchste enzymatische Aktivität bei 60 °C beobachtet. Diese LAPs können in vivo auch Hexamere bilden. Es wurde gezeigt, dass sich sechs 55‑kDa‑Protomere der enzymatisch inaktiven LAP‑A zu dem 353‑kDa‑bioaktiven LAP‑A‑Hexamer zusammenlagern. Strukturen sowohl des Protomers der LAP aus der Rinderlinse als auch des konstruierten biologisch aktiven Hexamers sind in der Protein Data Bank (PDB ID: 2J9A) verfügbar.

Mechanismen

In einem vorgeschlagenen Mechanismus ist das Hydrogencarbonat-Anion an eine Arginin-Seitenkette (Arg‑356 in PepA und Arg‑336 in LAP) gebunden und befindet sich in unmittelbarer Nähe zu zwei katalytischen Zinkionen. Es wird angenommen, dass das Hydrogencarbonat-Anion als allgemeine Base fungiert, die ein Proton vom zinküberbrückenden Wasser-Nukleophil aufnimmt und das Proton zur abgehenden Gruppe überträgt. Damit ist die Rolle des Hydrogencarbonat-Ions als allgemeine Base in PepA und LAP funktionell äquivalent zur katalytischen Funktion von Carboxylat-Seitenketten in den postulierten Mechanismen anderer Di-Zink- oder Mono-Zink-Peptidasen. Darüber hinaus stehen die beiden Zinkionen in Zusammenhang mit der Deprotonierung des Nukleophils zusammen mit Lys‑282, der Polarisierung der Substrat-Carbonylgruppe sowie der Stabilisierung des Übergangszustands. Der Bindungsmodus von Übergangszustandsanalogon-Inhibitoren an LAP, der eine symmetrische Überbrückung der beiden Zinkionen durch eines der gem-Diol-Sauerstoffatome zeigt, wird als vom angreifenden Nukleophil abgeleitet angesehen; dies steht im Gegensatz zu der Möglichkeit, dass das Wasser-Nukleophil vor dem nukleophilen Angriff eine terminale Koordination eingeht. Es wird angenommen, dass die Bindung des Nukleophils an zwei Metallionen dessen Nukleophilie reduziert. Darüber hinaus beeinflussen Art und Ladung der koordinierenden Liganden sowie die Dielektrizitätskonstante und das elektrostatische Potenzial der Proteinumgebung ebenfalls den pK_a-Wert und die Nukleophilie von Wasser.

Abbildung 1. Katalytische Mechanismen von PepA und LAP. (Sträter N; et al. 1999)

Biologische Funktionen

LAPs werden häufig als Enzyme der zellulären Aufrechterhaltung („Housekeeping“) mit entscheidender Bedeutung für den Peptidumsatz angesehen. LAPs gehören zu den Peptidasefamilien M1 oder M17. Bei Säugetieren tragen die M17- und M1-Enzyme mit LAP-Aktivität zur Peptidprozessierung für die MHC‑I‑Antigenpräsentation, zur Verarbeitung bioaktiver Peptide (Oxytocin, Vasopressin, Enkephaline) sowie zum Vesikeltransport zur Plasmamembran bei. In Mikroorganismen übernehmen LAPs der M17-Familie eine Rolle in der Proteolyse und weisen die Fähigkeit zur DNA-Bindung auf, wodurch LAPs als transkriptionelle Repressoren fungieren können, um die Biosynthese von Pyrimidin, Alginat und Choleratoxin zu steuern sowie ortsspezifische Rekombinationsereignisse in Plasmiden und Phagen zu regulieren. LAPs werden zudem mit Abwehrmechanismen, dem Membrantransport von Auxinrezeptoren und der Meiose in Verbindung gebracht. LAP kann auf Peptidverdau und Leucinfreisetzung hinweisen und die Aminosäureabsorption im Dünndarm repräsentieren. Neben ihrer Funktion als Housekeeping-Gen, das für den Proteinumsatz erforderlich ist, wurde für LAP‑A auch eine regulatorische Rolle in der Immunantwort der Tomate beschrieben. LAP‑A als Produkt des Octadecanoidwegs in einigen Solanaceen wurde eine regulatorische Funktion in der späten Wundantwort der Tomate zugeschrieben und ist die erste pflanzliche Aminopeptidase, für die eine regulatorische Funktion in einem Signaltransduktionsweg nachgewiesen wurde. LAP kann zudem in einer Vielzahl mariner Organismen exprimiert werden, um der osmotischen Belastung durch hohe Salzgehalte entgegenzuwirken; dabei initiiert LAP die Katalyse von Proteinen zur Freisetzung von Aminosäuren in die Zelle mit dem Ziel, die hohen Ionenkonzentrationen in der externen Umgebung auszugleichen.

Referenz