Penicillin-Amidase

Penicillin-Amidase (EC 3.5.1.11, PA, Penicillin-Acylase) gehört zur Klasse der Hydrolasen, Unterklasse der Aminohydrolasen, und stellt eine Gruppe sogenannter N-terminal nukleophiler Hydrolasen dar. Sie katalysiert die Umsetzung von Penicillin mit H₂O zu Carboxylat und 6‑Aminopenicillanat. Der systematische Name dieser Enzymklasse lautet Penicillin-Amidohydrolase. Weitere gebräuchliche Bezeichnungen sind Penicillin-Acylase, Benzylpenicillin-Acylase, Alpha-Acylamino-Beta-Lactam-Acylhydrolase und Ampicillin-Acylase. Penicillin-Amidase wurde in Bakterien, Hefen und Pilzen nachgewiesen. Ihre Hauptfunktion besteht in der Verwertung heterozyklischer Verbindungen als Kohlenstoffquelle.

Klassifizierung

Zur Einordnung der unterschiedlichen penicillinakzeptierenden Enzyme wurde eine Klassifizierung dieser Enzyme vorgeschlagen. Die Sammelbezeichnung für diese Enzymklasse lautet Alpha-Acylamino-Beta-Lactam-Acylhydrolase, mit einer Unterteilung in mehrere Typen entsprechend der bevorzugten Acylgruppe.

Tabelle 1. Klassifizierung der Alpha-Acylamino-Beta-Lactam-Acylhydrolase.

Struktur

Sowohl Spaltungs- als auch Kupplungsreaktionen können durch Penicillin-Amidase katalysiert werden. Das Enzym wird üblicherweise aus E. coli gewonnen. Es handelt sich um ein heterodimeres periplasmatisches Protein, bestehend aus einer kleinen α‑Untereinheit von 23 kD und einer großen β‑Untereinheit von 62 kD. Der katalytische Zyklus beginnt mit einem nukleophilen Angriff der Hydroxylgruppe des aktiven Serins, das am Aminoterminus der β‑Kette (bS1) lokalisiert ist, auf das Carbonylkohlenstoffatom der Amid- oder Esterbindung eines Substrats. Über ein tetraedrisches Oxyanion-Zwischenprodukt wird ein Acyl-Enzym gebildet, begleitet vom Abgang der Abgangsgruppe. Das Acyl-Enzym kann anschließend entweder durch einen β‑Lactam‑Nukleophil deacyliert werden, wodurch ein halbsynthetisches β‑Lactam‑Antibiotikum entsteht, oder durch H₂O, was zum Hydrolyseprodukt führt.

Abbildung 1. Struktur der Penicillin-Amidase. (D.B. Janssen)

Katalytischer Mechanismus

Penicillin-Amidase katalysiert die Übertragung einer Acylgruppe von einem Nukleophil auf ein anderes. Die Hydrolyse von Penicillin G entspricht der Übertragung einer Phenylacetylgruppe von 6‑Aminopenicillansäure auf Wasser. Der Mechanismus der Acylierung ist vergleichbar mit dem anderer Serin-Hydrolasen, wie Lipasen und Proteasen, und verläuft über ein Acyl-Enzym-Zwischenprodukt. Dieses kovalente Zwischenprodukt entsteht durch Acylierung der Hydroxylgruppe eines aktiven Serinrests durch Penicillin G unter Freisetzung von 6‑Aminopenicillansäure. Anschließend kann das Acyl-Enzym mit Wasser reagieren und Phenylacetat sowie das native Enzym bilden. Da alle Schritte reversibel sind, ist der umgekehrte Prozess – die Umwandlung von Säuren in Amide – prinzipiell bei niedriger Wasseraktivität möglich.

Abbildung 2. Mechanismus der durch Penicillin-Acylase katalysierten Amidhydrolyse. (Van Langen, L.M. 2001)

Bei den meisten Serin-Hydrolasen wird die Nukleophilie des Serinrests durch das gekoppelte Zusammenwirken benachbarter Aminosäurereste (katalytische Triade Asp‑His‑Ser) erhöht. Die Untersuchung der dreidimensionalen Struktur der Penicillin-Acylase zeigte jedoch keinen basischen Rest in der Nähe des katalytisch aktiven Serins. Daher wurde ein Mechanismus postuliert, bei dem die Hydroxylfunktion des aktiven Serins der Penicillin-Acylase durch ihre eigene N‑terminale Aminofunktion über ein brückendes Wassermolekül aktiviert wird. Das tetraedrische Oxyanion-Zwischenprodukt wird durch Wechselwirkungen mit den Hauptkettenamiden von B23 und B69 sowie dem Nδ von Asn241 stabilisiert.

Physiologische Funktion

Penicillin-Amidase ist üblicherweise in Organismen vorhanden, die Penicillin synthetisieren; die physiologische Rolle des Enzyms ist jedoch unklar. Im Vergleich zur dominierenden Rolle der β‑Lactamasen trägt das Enzym vermutlich nur in geringem Maße zur Resistenz gegenüber β‑Lactam‑Antibiotika bei, kann jedoch in bestimmten Organismen relevant sein. Beispielsweise wiesen hochresistente Stämme von Francisella tularensis sowohl β‑Lactamase- als auch Penicillin-Acylase-Aktivität auf. Darüber hinaus wurde während der Autolyse filamentöser Pilze eine Zunahme der PenG‑ und PenV‑Acylaseaktivität beobachtet.

Anwendung

Penicillin-Amidase wird seit mehr als 50 Jahren umfassend untersucht. In der Praxis wird dieses Enzym häufig zur Herstellung von 6‑Aminopenicillansäure eingesetzt, die das zentrale Synthone in der Herstellung von Penicillin-Antibiotika darstellt. Penicillin-Amidase wird zudem zur Synthese verschiedener halbsynthetischer β‑Lactam‑Antibiotika verwendet. Die breite Substratspezifität sowie die hohe Regio-, Chemo- und Stereoselektivität des Enzyms werden zur Herstellung chiraler Verbindungen (die in der modernen Pharmazeutik zunehmend nachgefragt werden) genutzt, ebenso wie zum Schutz von Hydroxy- und Aminogruppen in der Peptid- und Feinorganiksynthese.

Literatur