Polynukleotid-Kinase

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T4 Polynukleotidkinase (PNK) wurde ursprünglich in den Proteinauszügen von E. coli entdeckt, die mit T-even Phagen infiziert waren, und ist mittlerweile das Hauptreagenz, das in der molekularbiologischen Forschung verwendet wird. Das Produkt des frühen T4-Gens pseT, PNK, katalysiert den Transfer von γ-Phosphatgruppen von Adenosintriphosphat (ATP) oder anderen Nukleosidtriphosphaten zu den 5'-Hydroxylgruppen von Polynukleotiden unterschiedlicher Längen, Sequenzen und Typen. Sowohl doppelsträngige als auch einzelsträngige DNA, RNA und einzelne 3'-Phosphat-Nukleotidbasen können als Substrate für dieses Enzym verwendet werden. Darüber hinaus hat das Enzym 5'-Hydroxylkinase- und 2', 3'-zyklische Phosphodiesterase-Aktivitäten gegenüber mehreren Substraten. DNA-Reparaturenzyme, die konservierte Motive mit PNK teilen, wurden in Eukaryoten identifiziert. PNK enthält zwei funktionale Domänen und bildet ein Homotetramer. Die C-terminale Phosphatdomäne ist homolog zur Familie der L-2-Haloacid-Dehalogenasen, und die N-terminale Domäne ist homolog zur Adenylatkinase.

PNK funktionale Domänen

T4 PNK ist ein Homotetramer aus 301 Aminosäuren langen Polypeptiden. Obwohl es weit verbreitet in der Nukleinsäurebiochemie verwendet wird, sind die Struktur und der Mechanismus dieses bifunktionalen Enzyms noch unbekannt. Frühe Studien haben gezeigt, dass das C-Terminus von PNK an der 3'-Phosphatase-Funktion beteiligt ist, während das N-Terminus an der 5′-Kinase-Reaktion beteiligt ist. Einige Studien haben gerichtete Mutagenese verwendet, um die grundlegende Zusammensetzung der aktiven Stelle der 5'-Kinase und der 3'-Phosphatase-Aktivität zu lokalisieren. Die Aminosäuren, die erforderlich sind, um die 5'-Kinase-Reaktion zu katalysieren (Lys15, Ser16, Asp35, Arg38, Asp85 und Arg126), befinden sich hauptsächlich am N-Terminus, während die für die 3'-Phosphatase-Funktion notwendigen Reste (Asp165, Asp167, Arg176, Arg213, Asp254 und Asp278) hauptsächlich am C-Terminus konzentriert sind. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass es eine Domänengrenze zwischen Arg126 und Asp165 gibt. Die C-terminale Phosphatasedomäne kann ein stabiles Dimer bilden, und die N-terminale Domäne ist notwendig, damit das Enzym von Dimer zu Tetramer übergeht. Studien haben auch gezeigt, dass die 5'-Kinase-Domänen und 3'-Phosphatase-Domänen von PNK an der Domänengrenze physisch getrennt werden können und die 5'-Kinase-Aktivität möglicherweise durch die Oligomerisierung von PNK beeinflusst wird.   

Kristallstruktur der Kinasedomäne

Derzeit wurde die N-terminale Kinasedomäne von PNK (1-181) gelöst. Diese Struktur enthält ein kontinuierliches Polypeptid von PNK-Resten 1 bis 152, der N-terminale His-Tag und das C-terminale Fragment der Aminosäuren 153 bis 181 (die proximalen Fragmente der Phosphatasedomäne) sind ungeordnet und haben keine Elektronendichte. Die Kinasedomäne besteht aus einem zentralen viersträngigen parallelen β-Faltblatt mit drei α-Helices auf jeder Seite. Zwischen dem ersten β-Strang und der ersten α-Helix befindet sich ein Walker A-Box-Motiv (⁹GxxGxGKS¹⁶). Die klassische P-Schleifenstruktur, die in vielen nukleotidabhängigen Phosphotransferasen vorkommt, findet sich in der A-Box. Es gibt auch zwei Sulfationen, die an die P-Schleife und α2 in der PNK-Struktur binden. Das Kinase-Monomer der asymmetrischen Einheit steht über eine kristallographische 2-fach Achse mit einem anderen Monomer in Kontakt, und die α2–α3-Schleife sowie α1, β2, α2, α3 bilden eine Kontaktfläche von 2400 Ų (1200 Ų pro Protomer). Die Moleküle an der Schnittstelle sind hauptsächlich hydrophob, beinhalten jedoch auch Wasserstoffbrücken zwischen dem Hauptgerüst (von Asn31-Amid zu Ile41-Ketogruppe), von Seitenkette zu Hauptgerüst (von Asn31-Amid zu Ser40-Ketogruppe) und von Seitenkette zu Seitenkette (Asp36 Oδ1 zu His44Nε; Asp36 Oδ2 zu His44Nε und Ser40 Oγ).

Abb. 1. Struktur der 5′-Kinasedomäne (Wang, L.K.; et al. 2002)

PNK aktive Stelle

In der tertiären Struktur von PNK gibt es zwei geordnete Sulfationen. Das erste Sulfat hat umfangreiche Kontakte mit dem Rückgrat-Amidstickstoff der P-Schleife sowie den Resten Lys15 und Ser16 der A-Box, wobei sowohl Lys15 als auch Ser16 für die 5'-Kinase-Aktivität unerlässlich sind. Das Netzwerk der Sulfat- und P-Schleifen-Interaktionen in PNK-Kristallen stellt Kontakte dar, die zu dem β-Phosphat des Nukleotids in den Strukturen zahlreicher anderer P-Schleifen-haltiger Phosphotransferasen hergestellt werden. Daher kann geschlossen werden, dass das Sulfat die NTP-Bindungsstelle von PNK definiert. Das zweite Sulfation in der tertiären Struktur entspricht der Phosphat-Akzeptorstelle anderer P-Schleifen-haltiger Phosphotransferasen und ist 8,5 Å vom ersten Sulfation entfernt. Das zweite Sulfation ist koordiniert mit dem Hauptgerüst-Amidstickstoff von Thr86 und der Seitenketten-Oγ sowie den beiden terminalen Guanidinium-Stickstoffen von Arg38 (in α2).

Abb. 2. PNK aktive Stelle (Wang, L.K.; et al. 2002)