RecAf

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Homologe Rekombination spielt eine Schlüsselrolle bei der Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen, interstrangvernetzten DNA-Molekülen und kollabierten Replikationsgabeln; diese Funktionen sind entscheidend für die Aufrechterhaltung der genomischen Integrität. Sie spielt auch eine Schlüsselrolle bei der Erzeugung genetischer Vielfalt von Bakterien bis hin zu Menschen. Die Kernreaktion der Rekombination ist der Austausch von Strängen zwischen zwei homologen DNA-Molekülen, und dieser Prozess wird von der RecA-Familie der ATPasen katalysiert.

RecA verbindet sich in ATP-abhängiger Weise mit ssDNA, um einen helicalen Nukleoproteinfilament zu bilden, der ~6,2 RecA-Proteine pro Umdrehung und ungefähr 3 Nukleotide pro RecA-Protein hat. Die DNA wird unterwunden, um eine Form mit 18,5 Nukleotiden pro Umdrehung zu bilden, und hat einen durchschnittlichen Anstieg von 5,1 Å pro Nukleotid.

Die Suche nach rec-Genen

Clark und Margulies identifizierten erstmals recA 1965 in genetischen Screenings. Sie mutagenisierten F^--Bakterien und screeneten nach Stämmen, die sich nicht mit dem Hfr-Spenderstamm rekombinieren konnten. Nachfolgende Studien haben gezeigt, dass recA für sowohl den RecBCD- als auch den RecF-Weg der homologen Rekombination unerlässlich ist, und recA-Mutanten haben mehrere Funktionen, einschließlich der Beeinflussung der DNA-Reparatur, SOS-Mutagenese, Zellteilung, Chromosomen-Trennung und λ-Prophagen-Induktion, etc.

Zehn Jahre nach der Entdeckung des recA-Gens wurde das Protein erstmals gereinigt, und seine umfangreichen biochemischen Aktivitäten wurden berichtet, einschließlich DNA-Bindung, ATP-Hydrolyse, der Fähigkeit, Filamente auf DNA zu bilden, und der Fähigkeit, homologe DNA-Stränge auszutauschen. Studien haben berichtet, dass RecA ein 38 kDa Protein ist, mit ungefähr 1.000 Monomeren, die in jeder Zelle exprimiert werden, und bildet rechtsdrehende Nukleoproteinfilamente auf ssDNA und dsDNA.

In Abwesenheit von DNA-Schäden beträgt die Konzentration von RecA in vivo ungefähr 1 μM; jedoch wird die Konzentration von RecA während der SOS-Antwort etwa um das Zehnfache ansteigen. ATP-gebundene Nukleoproteinfilamente fungieren als Oberflächenkatalysatoren zur Suche und Erfassung homologer DNA-Sequenzen. Sobald ein Homologiebereich gefunden wird, werden die ssDNA-Stränge auf den homologen Chromosomen ausgetauscht, um heteroduplexe DNA zu erzeugen (das heißt, jeder Einzelstrang stammt von einem anderen Chromosom).  

Die Suche nach strukturellen Hinweisen: Einblicke aus der Elektronenmikroskopie

In den letzten dreißig Jahren haben Menschen durch hochauflösende Elektronenmikroskopie die meisten Informationen über das RecA-Nukleoproteinfilament erhalten und somit ein tieferes Verständnis der morphologischen Veränderungen der Nukleoproteinstruktur während des Rekombinationsprozesses erlangt. Unter physiologischen Bedingungen faltet sich ssDNA in mehrere Strukturen, die durch lokalisierte Anlagerung kurzer komplementärer Regionen (sekundäre Struktur) stabilisiert werden, die die Bildung von RecA-Filamenten hemmen. Die DNA-sekundäre Struktur wird weitgehend durch ssDNA-bindende Proteine (SSB) überwunden, die ssDNA fest mit SSB binden und die sekundäre Struktur effektiv denaturieren.

SSB-beschichtete ssDNA ist dichter als dsDNA und unterscheidet sich in der Morphologie von RecA-Filamenten, da jedes Tetramer von SSB sich um 30-70 Nukleotide um sich selbst wickelt. Wenn RecA-Filamente zusammen mit ATP gebildet werden und hydrolysiert werden, um eine große Menge ADP zu erzeugen, sind die RecA-Filamente in der Steigung entlang eines einzelnen Filaments heterogen, was mit dem Modell der lokalisierten und kooperativen ATP-Hydrolyse übereinstimmt. Obwohl das mutierte RecA-Protein die Fähigkeit hat, ssDNA zu binden und ATP zu hydrolysieren, kann es ssDNA nicht auf die kanonische Filamentlänge dehnen, sodass es die Synapsis und den DNA-Strang-Austausch nicht katalysieren kann, was darauf hinweist, dass das Dehnen von DNA für den DNA-Strang-Austausch notwendig ist.

Abb. 1. a. Elektronenmikroskopie von DNA-freiem RecA, das heterogene Oligomerisierungszustände von RecA zeigt.
b. Elektronenmikroskopie der Filamentbildung von RecA auf SSB-beschichteter zirkulärer ssDNA (Bell, J.C.; Kowalczykowski, S.C. 2016)

Gesamtstruktur des RecA-ssDNA-Filaments

RecA besteht aus einem 30-Rest-Aminoterminal-a2b-Motiv, einem 240-Rest-α/β-ATPase-Kern und einer 64-Rest-globulären Domäne (CTD), die den ATPase-Kern verwendet, um an ssDNA zu binden. ADP-AlF₄-Mg bindet an die Schnittstelle der beiden RecA-Promotoren, und ssDNA befindet sich sehr nahe an der Filamentachse und wickelt sich um sie.

Die Ebenen der Basen sind grob orthogonal zur Filamentachse, und ihre Watson-Crick-Kante liegt innerhalb von 1,0 Å, während das DNA-Rückgrat am äußersten Ende der Achse liegt. Das Ende von ssDNA bindet an das N-terminale RecA des Fusionsproteins.

Das RecA-ssDNA-Filament unterscheidet sich von den vorherigen kristallinen Filamenten, hauptsächlich weil die Richtung des Rekombinase relativ zur Filamentachse unterschiedlich ist, was sich von der RecA-RecA-Beziehung mit der Position und dem Platz für das DNA-Bindelement unterscheidet.

Abb. 2. Struktur des präsynaptischen Nukleoproteinfilaments (Chen, Z.C.; et al. 2008)