mRNA-basierte Therapien und Impfstoffe haben sich als revolutionärer Ansatz im Bereich der Medizin herauskristallisiert und bieten ein vielseitiges und leistungsstarkes Werkzeug zur Bekämpfung einer Vielzahl von Krankheiten. Der Erfolg von mRNA-Impfstoffen, wie denen, die für COVID-19 entwickelt wurden, hat das Potenzial dieser Technologie und die Notwendigkeit effizienter Techniken zur großtechnischen Produktion hervorgehoben. Die Hochskalierung der mRNA-Produktion umfasst die Überwindung mehrerer Herausforderungen, einschließlich der Optimierung von Synthese, Reinigung und der Gewährleistung von Produktqualität und Konsistenz. Dieser Artikel bietet einen umfassenden Überblick über die Techniken und Strategien, die in der großtechnischen mRNA-Produktion verwendet werden.

Überblick über den mRNA-Produktionsprozess

Die Produktion von mRNA umfasst mehrere wichtige Schritte, einschließlich der in vitro Transkription (IVT), Reinigung und posttranskriptionalen Modifikationen. IVT ist der Prozess, bei dem mRNA aus einer DNA-Vorlage unter Verwendung eines RNA-Polymerase-Enzyms synthetisiert wird. Nach der Transkription muss die mRNA gereinigt werden, um Verunreinigungen wie Enzyme, verbleibende DNA und abnormale mRNA-Spezies zu entfernen. Posttranskriptionale Modifikationen, wie die Hinzufügung einer 5'-Kappe und Polyadenylierung, werden dann durchgeführt, um die Stabilität und Übersetzungseffizienz der mRNA zu verbessern.

In Vitro Transkription (IVT) Techniken

Traditionelle IVT-Methoden

Traditionelle IVT-Methoden beinhalten die Verwendung einer DNA-Vorlage, RNA-Polymerase und Nukleotide zur Synthese von mRNA in einem Reaktionsgemisch. Diese Methoden sind gut etabliert und werden in Laborumgebungen weit verbreitet eingesetzt. Sie sind jedoch möglicherweise nicht leicht für die großtechnische Produktion skalierbar. Eine der Herausforderungen bei traditionellen IVT ist die Entfernung der DNA-Vorlage nach der Transkription, die typischerweise durch DNase-Digestion erreicht wird. Dieser Schritt kann zeitaufwendig sein und zusätzliche Reinigungsherausforderungen mit sich bringen.

Abbildung 1. Schematische Darstellung der in vitro Transkription (IVT) von mRNA. mRNA wird in vitro unter Verwendung einer linearen DNA-Vorlage und RNA-Polymerase (T7) synthetisiert. Die IVT-mRNA besteht aus fünf Domänen: 5'-Kappe, 5'- und 3'-UTR, einem ORF, der das Zielprotein kodiert, und einem Poly(A)-Schwanz. (Ma et al., 2023)

Solid-Phase IVT

Solid-Phase-IVT ist ein innovativer Ansatz, der einige der Einschränkungen traditioneller IVT-Methoden adressiert. Bei dieser Technik wird die DNA-Vorlage auf einem festen Träger, wie magnetischen Perlen, immobilisiert, was eine direkte Skalierung von kleinen auf große Volumina ermöglicht. Die immobilisierte Vorlage ermöglicht eine effiziente Transkription und vereinfacht den Reinigungsprozess, da die mRNA leicht durch Waschen der Perlen vom Reaktionsgemisch getrennt werden kann. Diese Methode bietet erhebliche Vorteile in Bezug auf Skalierbarkeit und Automatisierung. Beispielsweise ist es mit automatisierten Handhabungsgeräten für magnetische Perlen möglich, bis zu 24 Wells (insgesamt 48 mL IVT) parallel zu verarbeiten und bis zu 150 mg gereinigte mRNA zu produzieren. Alternativ kann die Hochskalierung in einem Reaktor bis zu 3 g gereinigte mRNA in einer einzigen 1L-IVT-Reaktion ergeben.

Abbildung 2. RNA-Solid-Phase-Synthesezyklus. Die gebräuchlichsten Ansätze basieren auf temporärer Schutz mit der 4,4'-Dimethoxytrityl (DMT)-Gruppe und Kopplung unter Verwendung der Phosphoramidit-Chemie. Abkürzungen: 2-Cyanoethyl (CE). (Flemmich et al., 2024)

Reinigungstechniken

Chromatographiemethoden

Chromatographie ist ein gängiger Reinigungsprozess, der in der pharmazeutischen Industrie aufgrund seiner Selektivität, Vielseitigkeit, Skalierbarkeit und Kosteneffizienz weit akzeptiert ist. Mehrere Chromatographietechniken wurden zur Reinigung von mRNA untersucht, einschließlich der Größenausschlusschromatographie (SEC), der Ionenaustauschchromatographie (IEC) und der Affinitätschromatographie.

• Größenausschlusschromatographie (SEC): SEC trennt Moleküle basierend auf ihrer Größe und gilt als die einfachste Form der Chromatographie zur Reinigung von Oligonukleotiden. Sie kann effektiv unreaktive Nukleotide, Enzyme, kurze Transkripte und hochmolekulare DNA-Vorlagen von den gewünschten IVT-mRNA-Produkten entfernen. SEC hat jedoch Einschränkungen bei der Entfernung von Verunreinigungen ähnlicher Größe, wie dsDNA.
• Ionenaustauschchromatographie (IEC): IEC nutzt den Ladungsunterschied zwischen der Ziel-mRNA-Spezies und verschiedenen Verunreinigungen. Diese Technik ist skalierbar, kosteneffektiv und ermöglicht die Trennung längerer RNA-Transkripte. Schwache Anionenaustauschchromatographie wurde erfolgreich implementiert, um mRNA von IVT-Verunreinigungen zu trennen. IEC muss jedoch unter denaturierenden Bedingungen durchgeführt werden, was die Komplexität des Prozesses erhöht.
• Affinitätschromatographie: Affinitätschromatographie unter Verwendung von Oligo-dT ist eine weit verbreitete Methode zur Auffangung von mRNA durch Bindung an ihren Poly(A)-Schwanz. Diese Technik produziert hochreine Produkte, die für cGMP geeignet sind, hat jedoch Einschränkungen in Bezug auf Bindungskapazität und Kosteneffizienz.

Nicht-Chromatographiemethoden

Nicht-Chromatographiemethoden, wie die tangentiale Flussfiltration (TFF), haben sich als schnelle und effiziente Alternativen zur großtechnischen mRNA-Reinigung herausgestellt. TFF beinhaltet das Filtern und Konzentrieren von Lösungen, die biologische Moleküle enthalten, indem die Flüssigkeit tangential zur Filteroberfläche fließt. Diese Methode kann mit der mRNA-Fällung kombiniert werden, um traditionelle Fällungsmethoden zu ersetzen. TFF wurde erfolgreich im Produktionsprozess von zugelassenen COVID-19-mRNA-Impfstoffen angewendet.

Prozessentwicklung und -optimierung

Skalierbare Plattformprozesse

Die Entwicklung skalierbarer Plattformprozesse ist entscheidend für die großtechnische mRNA-Produktion. Ein skalierbarer downstream-Plattformprozess umfasst typischerweise mehrere Betriebseinheiten, wie Ultrafiltration/Diafiltration (UF/DF), Chromatographie und Filtration und Abfüllung des Bulk-Arzneistoffs. Beispielsweise wurde ein Plattformprozess basierend auf einer 300 mL IVT-Reaktion entwickelt und als skalierbar in Schritten von 300 mL demonstriert. Dieser Prozess ergibt etwa 80 % gereinigte mRNA-Bulk-Arzneistoff im Vergleich zum nicht skalierbaren Lithiumchlorid-Reinigungsprozess. Die Reinigungsoperationen beseitigen Prozessrückstände und Produktverunreinigungen, einschließlich dsRNA.

Prozessoptimierungsstrategien

Die Optimierung des mRNA-Produktionsprozesses umfasst mehrere Strategien, einschließlich der Verbesserung der Reaktionsbedingungen, der Auswahl geeigneter Reinigungsmethoden und der Implementierung effizienter downstream-Verarbeitung. Beispielsweise kann die Optimierung der IVT-Reaktionsbedingungen, wie Temperatur, pH und Reagenzkonzentrationen, den mRNA-Ertrag und die Qualität verbessern. Darüber hinaus kann die Auswahl der richtigen Chromatographieharze und Membranen zur Reinigung die Prozesseffizienz und Skalierbarkeit verbessern. Die Implementierung von in-prozess analytischen Werkzeugen, wie der Größenausschlusschromatographie (SEC) zur Bewertung der mRNA-Reinheit, kann ebenfalls zur Prozessoptimierung beitragen.

Herausforderungen und zukünftige Richtungen

Lieferketten- und Rohstoffbeschränkungen

Eine der wesentlichen Herausforderungen bei der großtechnischen mRNA-Produktion sind die Lieferketten- und Rohstoffbeschränkungen. Die Verfügbarkeit von hochwertigen Rohstoffen, wie Nukleotiden und Enzymen, ist entscheidend für eine konsistente mRNA-Produktion. Die Bewältigung dieser Herausforderungen erfordert risikobasierte Strategien, wie sie in den FDA Q9 Quality Risk Management Guidelines empfohlen werden. Die Implementierung zusätzlicher Kontrollen, wie die Freigabetests von eingehenden Materialien und die Lieferantenprüfungen auf RNase, kann helfen, diese Risiken zu mindern.

Creative Enzymes hebt sich als vertrauenswürdiger Partner hervor und bietet eine robuste Versorgung mit GMP-qualifizierten Enzymen, die durch strenge Qualitätskontrollen und regulatorische Unterstützung gestützt wird. Mit unserem Fachwissen und unserer Zuverlässigkeit helfen wir Ihnen, die Grundlage für eine konforme, ertragreiche mRNA-Produktion zu legen.

Kühl- und Lieferanforderungen

Eine weitere Herausforderung sind die Kühl- und Lieferanforderungen von mRNA-Produkten. mRNA ist empfindlich gegenüber Abbau, und die Aufrechterhaltung ihrer Stabilität während der Lagerung und des Transports ist entscheidend. Die Entwicklung stabilerer Formulierungen und Liefersysteme kann helfen, diese Herausforderungen zu bewältigen.

Innovationen in der mRNA-Produktion

Zukünftige Innovationen in der mRNA-Produktion könnten sich auf die Verbesserung der Skalierbarkeit, die Senkung der Kosten und die Verbesserung der Produktqualität konzentrieren. Beispielsweise kann die Entwicklung effizienterer Solid-Phase-IVT-Methoden und neuartiger Reinigungstechniken den Produktionsprozess weiter optimieren. Darüber hinaus können Fortschritte in den mRNA-Liefersystemen, wie Lipidnanopartikeln, die Stabilität und Wirksamkeit von mRNA-basierten Therapien verbessern.

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