mRNA-basierte Therapien und Impfstoffe haben sich als revolutionärer Ansatz im Bereich der Medizin etabliert und bieten ein vielseitiges und leistungsstarkes Werkzeug zur Behandlung einer Vielzahl von Krankheiten. Der Erfolg von mRNA-Impfstoffen, wie sie beispielsweise für COVID-19 entwickelt wurden, hat das Potenzial dieser Technologie sowie die Notwendigkeit effizienter großtechnischer Produktionstechniken hervorgehoben. Die Hochskalierung der mRNA-Produktion erfordert die Überwindung mehrerer Herausforderungen, darunter die Optimierung der Synthese, Reinigung und die Sicherstellung von Produktqualität und -konsistenz. Dieser Artikel bietet einen umfassenden Überblick über die Techniken und Strategien, die bei der großtechnischen mRNA-Produktion eingesetzt werden.

Überblick über den mRNA-Produktionsprozess

Die Herstellung von mRNA umfasst mehrere wichtige Schritte, darunter die in vitro Transkription (IVT), Reinigung und posttranskriptionelle Modifikationen. IVT ist der Prozess, bei dem mRNA aus einer DNA-Vorlage unter Verwendung eines RNA-Polymerase-Enzyms synthetisiert wird. Nach der Transkription muss die mRNA gereinigt werden, um Verunreinigungen wie Enzyme, Rest-DNA und abweichende mRNA-Spezies zu entfernen. Anschließend werden posttranskriptionelle Modifikationen, wie das Hinzufügen einer 5'-Kappe und die Polyadenylierung, durchgeführt, um die Stabilität und Translationseffizienz der mRNA zu erhöhen.

In vitro Transkriptions-(IVT)-Techniken

Traditionelle IVT-Methoden

Traditionelle IVT-Methoden beinhalten die Verwendung einer DNA-Vorlage, RNA-Polymerase und Nukleotiden zur Synthese von mRNA in einem Reaktionsgemisch. Diese Methoden sind gut etabliert und werden häufig in Laborumgebungen eingesetzt. Allerdings sind sie möglicherweise nicht einfach auf großtechnische Produktion skalierbar. Eine der Herausforderungen bei traditionellen IVT-Methoden ist die Entfernung der DNA-Vorlage nach der Transkription, was typischerweise durch DNase-Verdau erreicht wird. Dieser Schritt kann zeitaufwendig sein und zusätzliche Herausforderungen bei der Reinigung mit sich bringen.

Abbildung 1. Schematische Darstellung der in vitro Transkription (IVT) von mRNA. mRNA wird in vitro unter Verwendung einer linearen DNA-Vorlage und RNA-Polymerase (T7) synthetisiert. Die IVT-mRNA besteht aus fünf Domänen: 5'-Kappe, 5'- und 3'-UTR, einem ORF, der das gewünschte Protein codiert, und einem Poly(A)-Schwanz. (Ma et al., 2023)

Festphasen-IVT

Festphasen-IVT ist ein innovativer Ansatz, der einige der Einschränkungen traditioneller IVT-Methoden adressiert. Bei dieser Technik wird die DNA-Vorlage an einem festen Träger, wie z. B. magnetischen Beads, immobilisiert, was eine direkte Skalierbarkeit von kleinen zu großen Volumina ermöglicht. Die immobilisierte Vorlage erlaubt eine effiziente Transkription und vereinfacht den Reinigungsprozess, da die mRNA durch Waschen der Beads leicht vom Reaktionsgemisch getrennt werden kann. Diese Methode bietet erhebliche Vorteile hinsichtlich Skalierbarkeit und Automatisierbarkeit. Beispielsweise ist es mit automatisierten magnetischen Bead-Handlern möglich, bis zu 24 Wells (insgesamt 48 mL IVT) parallel zu verarbeiten und bis zu 150 mg gereinigte mRNA zu produzieren. Alternativ kann das Hochskalieren in einem Reaktor bis zu 3 g gereinigte mRNA in einer einzigen 1L-IVT-Reaktion ergeben.

Abbildung 2. RNA-Festphasensynthesezyklus. Die gebräuchlichsten Ansätze beruhen auf temporärem Schutz mit der 4,4'-Dimethoxytrityl-(DMT)-Gruppe und Kupplung mittels Phosphoramidit-Chemie. Abkürzungen: 2-Cyanoethyl (CE). (Flemmich et al., 2024)

Reinigungstechniken

Chromatographische Methoden

Chromatographie ist ein gängiges Reinigungsverfahren, das in der pharmazeutischen Industrie aufgrund seiner Selektivität, Vielseitigkeit, Skalierbarkeit und Kosteneffizienz weit verbreitet ist. Für die mRNA-Reinigung wurden verschiedene chromatographische Techniken untersucht, darunter Größenausschlusschromatographie (SEC), Ionenaustauschchromatographie (IEC) und Affinitätschromatographie.

• Größenausschlusschromatographie (SEC): SEC trennt Moleküle basierend auf ihrer Größe und gilt als die einfachste Form der Chromatographie zur Reinigung von Oligonukleotiden. Sie kann effektiv nicht umgesetzte Nukleotide, Enzyme, kurze Transkripte und hochmolekulare DNA-Vorlagen von den gewünschten IVT-mRNA-Produkten entfernen. Allerdings hat SEC Einschränkungen bei der Entfernung von Verunreinigungen ähnlicher Größe, wie z. B. dsDNA.
• Ionenaustauschchromatographie (IEC): IEC nutzt den Ladungsunterschied zwischen der Ziel-mRNA und verschiedenen Verunreinigungen. Diese Technik ist skalierbar, kosteneffizient und ermöglicht die Trennung längerer RNA-Transkripte. Schwache Anionenaustauschchromatographie wurde erfolgreich eingesetzt, um mRNA von IVT-Verunreinigungen zu trennen. Allerdings muss IEC unter denaturierenden Bedingungen durchgeführt werden, was den Prozess komplexer macht.
• Affinitätschromatographie: Die Affinitätschromatographie mit Oligo-dT ist eine weit verbreitete Methode zur Anreicherung von mRNA durch Bindung an deren Poly(A)-Schwanz. Diese Technik liefert hochreine Produkte, die für cGMP geeignet sind, hat jedoch Einschränkungen hinsichtlich Bindekapazität und Kosteneffizienz.

Nicht-chromatographische Methoden

Nicht-chromatographische Methoden wie die tangentiale Flussfiltration (TFF) haben sich als schnelle und effiziente Alternativen für die großtechnische mRNA-Reinigung etabliert. TFF beinhaltet das Filtern und Konzentrieren von Lösungen, die biologische Moleküle enthalten, indem die Flüssigkeit tangential zur Filteroberfläche geführt wird. Diese Methode kann mit der mRNA-Fällung kombiniert werden, um traditionelle Fällungsmethoden zu ersetzen. TFF wurde erfolgreich im Produktionsprozess zugelassener COVID-19-mRNA-Impfstoffe eingesetzt.

Prozessentwicklung und -optimierung

Skalierbare Plattformprozesse

Die Entwicklung skalierbarer Plattformprozesse ist entscheidend für die großtechnische mRNA-Produktion. Ein skalierbarer Downstream-Plattformprozess umfasst typischerweise mehrere Einzelschritte, wie Ultrafiltration/Diafiltration (UF/DF), Chromatographie sowie Filtration und Abfüllung des Wirkstoff-Bulks. Beispielsweise wurde ein Plattformprozess auf Basis einer 300-mL-IVT-Reaktion entwickelt und in 300-mL-Schritten als skalierbar demonstriert. Dieser Prozess liefert etwa 80 % gereinigte mRNA-Bulk-Wirkstoffsubstanz im Vergleich zum nicht skalierbaren Lithiumchlorid-Reinigungsprozess. Die Reinigungsschritte eliminieren Prozessrückstände und Produktverunreinigungen, einschließlich dsRNA.

Strategien zur Prozessoptimierung

Die Optimierung des mRNA-Produktionsprozesses umfasst verschiedene Strategien, darunter die Verbesserung der Reaktionsbedingungen, die Auswahl geeigneter Reinigungsmethoden und die Implementierung effizienter Downstream-Prozesse. Beispielsweise kann die Optimierung der IVT-Reaktionsbedingungen, wie Temperatur, pH-Wert und Reagenzienkonzentrationen, die Ausbeute und Qualität der mRNA erhöhen. Darüber hinaus kann die Auswahl der richtigen Chromatographieharze und Membranen für die Reinigung die Prozesseffizienz und Skalierbarkeit verbessern. Der Einsatz von In-Prozess-Analytik, wie Größenausschlusschromatographie (SEC) zur Beurteilung der mRNA-Reinheit, kann ebenfalls zur Prozessoptimierung beitragen.

Herausforderungen und zukünftige Entwicklungen

Lieferkette und Rohstoffengpässe

Eine der größten Herausforderungen bei der großtechnischen mRNA-Produktion sind Engpässe in der Lieferkette und bei Rohstoffen. Die Verfügbarkeit hochwertiger Rohstoffe, wie Nukleotide und Enzyme, ist entscheidend für eine konsistente mRNA-Produktion. Die Bewältigung dieser Herausforderungen erfordert risikobasierte Strategien, wie sie beispielsweise in der FDA Q9 Quality Risk Management Guidance empfohlen werden. Die Implementierung zusätzlicher Kontrollen, wie Freigabetests für eingehende Materialien und lieferantenbasierte Tests auf RNase, kann helfen, diese Risiken zu minimieren.

Creative Enzymes zeichnet sich als vertrauenswürdiger Partner aus und bietet eine zuverlässige Versorgung mit GMP-konformen Enzymen, unterstützt durch strenge Qualitätskontrollen und regulatorische Unterstützung. Mit unserer Expertise und Zuverlässigkeit helfen wir Ihnen, die Grundlage für eine regelkonforme, ertragreiche mRNA-Produktion zu legen.

Anforderungen an Kühlkette und Auslieferung

Eine weitere Herausforderung sind die Anforderungen an die Kühlkette und Auslieferung von mRNA-Produkten. mRNA ist empfindlich gegenüber Abbau, und die Aufrechterhaltung ihrer Stabilität während Lagerung und Transport ist essenziell. Die Entwicklung stabilerer Formulierungen und Liefersysteme kann helfen, diese Herausforderungen zu bewältigen.

Innovationen in der mRNA-Produktion

Zukünftige Innovationen in der mRNA-Produktion könnten sich auf die Verbesserung der Skalierbarkeit, die Senkung der Kosten und die Steigerung der Produktqualität konzentrieren. Beispielsweise kann die Entwicklung effizienterer Festphasen-IVT-Methoden und neuer Reinigungstechniken den Produktionsprozess weiter optimieren. Darüber hinaus können Fortschritte bei mRNA-Transportsystemen, wie Lipid-Nanopartikeln, die Stabilität und Wirksamkeit mRNA-basierter Therapien verbessern.

Empfohlene Produkte

Die Hochskalierung der mRNA-Produktion bringt neue Komplexitätsstufen mit sich und erfordert robuste Prozesse, hocheffiziente Arbeitsabläufe und Enzyme, die unter intensiven Bedingungen zuverlässig funktionieren. Die von Creative Enzymes angebotenen Spezialenzyme sind darauf ausgelegt, den Anforderungen der großtechnischen Herstellung gerecht zu werden – von der Hochdurchsatz-Plasmid-Linearisation bis hin zu effizienter in vitro Transkription, Capping und Polyadenylierung. Durch konsistente Leistung und technische Expertise unterstützen wir die skalierbare Produktion von mRNA-Therapeutika und -Impfstoffen und helfen, den globalen Gesundheitsbedarf im industriellen Maßstab zu decken. Kontaktieren Sie uns noch heute für weitere Informationen und persönliche Beratung.