mRNA-basierte Therapien und Impfstoffe haben sich als revolutionärer Ansatz in der Medizin etabliert und bieten ein vielseitiges und leistungsfähiges Instrument zur Behandlung eines breiten Spektrums von Erkrankungen. Der Erfolg von mRNA-Impfstoffen, wie etwa der für COVID-19 entwickelten, hat das Potenzial dieser Technologie sowie den Bedarf an effizienten Produktionsverfahren im industriellen Maßstab verdeutlicht. Die Skalierung der mRNA-Produktion erfordert die Bewältigung mehrerer Herausforderungen, darunter die Optimierung von Synthese und Aufreinigung sowie die Sicherstellung von Produktqualität und -konsistenz. Dieser Artikel gibt einen umfassenden Überblick über die in der großtechnischen mRNA-Produktion eingesetzten Techniken und Strategien.

Überblick über den mRNA-Produktionsprozess

Die Herstellung von mRNA umfasst mehrere zentrale Schritte, darunter die In-vitro-Transkription (IVT), die Aufreinigung sowie posttranskriptionelle Modifikationen. Bei der IVT wird mRNA ausgehend von einer DNA-Matrize mithilfe einer RNA-Polymerase synthetisiert. Nach der Transkription muss die mRNA aufgereinigt werden, um Kontaminanten wie Enzyme, residuale DNA und aberrante mRNA-Spezies zu entfernen. Anschließend werden posttranskriptionelle Modifikationen wie das Anfügen einer 5'-Cap-Struktur und die Polyadenylierung durchgeführt, um die Stabilität und Translationseffizienz der mRNA zu erhöhen.

In-vitro-Transkription (IVT)-Techniken

Traditionelle IVT-Methoden

Traditionelle IVT-Methoden basieren auf der Verwendung einer DNA-Matrize, einer RNA-Polymerase und Nukleotiden zur Synthese von mRNA in einem Reaktionsansatz. Diese Verfahren sind etabliert und werden in Laborumgebungen breit eingesetzt. Für die Produktion im großen Maßstab sind sie jedoch nicht immer ohne Weiteres skalierbar. Eine Herausforderung besteht in der Entfernung der DNA-Matrize nach der Transkription, die typischerweise durch DNase-Verdau erfolgt. Dieser Schritt kann zeitaufwendig sein und zusätzliche Anforderungen an die nachgelagerte Aufreinigung mit sich bringen.

Abbildung 1. Schematische Darstellung der In-vitro-Transkription (IVT) von mRNA. mRNA wird in vitro unter Verwendung einer linearen DNA-Matrize und einer RNA-Polymerase (T7) synthetisiert. Die IVT-mRNA besteht aus fünf Domänen: 5'-Cap, 5'- und 3'-UTR, einem ORF, der das Zielprotein kodiert, sowie einem Poly(A)-Schwanz. (Ma et al., 2023)

Festphasen-IVT

Die Festphasen-IVT ist ein innovativer Ansatz, der einige Einschränkungen traditioneller IVT-Methoden adressiert. Dabei wird die DNA-Matrize auf einem festen Träger, z. B. magnetischen Beads, immobilisiert, wodurch eine direkte Skalierung von kleinen auf große Volumina ermöglicht wird. Die immobilisierte Matrize erlaubt eine effiziente Transkription und vereinfacht die Aufreinigung, da die mRNA durch Waschen der Beads leicht vom Reaktionsgemisch getrennt werden kann. Dieses Verfahren bietet erhebliche Vorteile hinsichtlich Skalierbarkeit und Automatisierbarkeit. Beispielsweise können mit automatisierten Magnetbead-Handlern bis zu 24 Wells (insgesamt 48 mL IVT) parallel verarbeitet und bis zu 150 mg aufgereinigte mRNA hergestellt werden. Alternativ kann eine Skalierung im Reaktor in einer einzelnen 1-L-IVT-Reaktion bis zu 3 g aufgereinigte mRNA liefern.

Abbildung 2. Zyklus der RNA-Festphasensynthese. Die gängigsten Ansätze basieren auf einer temporären Schutzgruppenstrategie mit der 4,4'-Dimethoxytrityl-(DMT)-Gruppe und der Kupplung mittels Phosphoramidit-Chemie. Abkürzungen: 2-Cyanoethyl (CE). (Flemmich et al., 2024)

Aufreinigungstechniken

Chromatographische Verfahren

Die Chromatographie ist ein etabliertes Aufreinigungsverfahren, das in der pharmazeutischen Industrie aufgrund seiner Selektivität, Vielseitigkeit, Skalierbarkeit und Kosteneffizienz breit akzeptiert ist. Für die mRNA-Aufreinigung wurden verschiedene chromatographische Techniken untersucht, darunter Größenausschlusschromatographie (SEC), Ionenaustauschchromatographie (IEC) und Affinitätschromatographie.

• Größenausschlusschromatographie (SEC): SEC trennt Moleküle anhand ihrer Größe und gilt als die einfachste Form der Chromatographie zur Aufreinigung von Oligonukleotiden. Sie kann nicht umgesetzte Nukleotide, Enzyme, kurze Transkripte sowie hochmolekulare DNA-Matrizen effektiv aus den gewünschten IVT-mRNA-Produkten entfernen. Allerdings ist SEC in der Entfernung von Verunreinigungen ähnlicher Größe, wie z. B. dsDNA, limitiert.
• Ionenaustauschchromatographie (IEC): IEC nutzt Ladungsunterschiede zwischen der Ziel-mRNA und verschiedenen Verunreinigungen. Diese Technik ist skalierbar, kosteneffizient und ermöglicht die Trennung längerer RNA-Transkripte. Eine schwache Anionenaustauschchromatographie wurde erfolgreich eingesetzt, um mRNA von IVT-bedingten Verunreinigungen zu trennen. IEC muss jedoch unter denaturierenden Bedingungen durchgeführt werden, was die Prozesskomplexität erhöht.
• Affinitätschromatographie: Die Affinitätschromatographie mit Oligo-dT ist ein weit verbreitetes Verfahren zur Anreicherung von mRNA durch Bindung an den Poly(A)-Schwanz. Diese Technik liefert hochreine Produkte, die für cGMP geeignet sind, weist jedoch Einschränkungen hinsichtlich Bindekapazität und Kosteneffizienz auf.

Nicht-chromatographische Verfahren

Nicht-chromatographische Verfahren wie die Tangentialflussfiltration (TFF) haben sich als schnelle und effiziente Alternativen für die großtechnische mRNA-Aufreinigung etabliert. Bei der TFF werden Lösungen mit biologischen Molekülen filtriert und konzentriert, indem die Flüssigkeit tangential zur Filteroberfläche geführt wird. Dieses Verfahren kann mit einer mRNA-Fällung kombiniert werden, um klassische Fällungsmethoden zu ersetzen. TFF wurde erfolgreich im Herstellprozess zugelassener COVID-19-mRNA-Impfstoffe eingesetzt.

Prozessentwicklung und -optimierung

Skalierbare Plattformprozesse

Die Entwicklung skalierbarer Plattformprozesse ist für die großtechnische mRNA-Produktion entscheidend. Ein skalierbarer Downstream-Plattformprozess umfasst typischerweise mehrere Unit Operations, wie Ultrafiltration/Diafiltration (UF/DF), Chromatographie sowie Filtration und Abfüllung des Bulk Drug Substance. Beispielsweise wurde ein Plattformprozess auf Basis einer 300-mL-IVT-Reaktion entwickelt und eine Skalierbarkeit in 300-mL-Inkrementen demonstriert. Dieser Prozess liefert im Vergleich zum nicht skalierbaren Lithiumchlorid-Aufreinigungsverfahren etwa 80 % aufgereinigte mRNA als Bulk Drug Substance. Die Aufreinigungsschritte eliminieren Prozessrückstände und Produktkontaminanten, einschließlich dsRNA.

Strategien zur Prozessoptimierung

Die Optimierung des mRNA-Herstellprozesses umfasst mehrere Strategien, darunter die Verbesserung der Reaktionsbedingungen, die Auswahl geeigneter Aufreinigungsmethoden und die Implementierung effizienter Downstream-Prozessierung. So kann die Optimierung der IVT-Reaktionsbedingungen, wie Temperatur, pH-Wert und Reagenzienkonzentrationen, Ausbeute und Qualität der mRNA erhöhen. Darüber hinaus kann die Auswahl geeigneter Chromatographieharze und Membranen die Prozesseffizienz und Skalierbarkeit verbessern. Der Einsatz von In-Process-Analytik, z. B. SEC zur Beurteilung der mRNA-Reinheit, kann ebenfalls zur Prozessoptimierung beitragen.

Herausforderungen und zukünftige Entwicklungen

Lieferkette und Einschränkungen bei Rohmaterialien

Eine wesentliche Herausforderung der großtechnischen mRNA-Produktion sind Einschränkungen in der Lieferkette und bei Rohmaterialien. Die Verfügbarkeit hochwertiger Ausgangsmaterialien, wie Nukleotide und Enzyme, ist entscheidend für eine konsistente mRNA-Herstellung. Die Bewältigung dieser Herausforderungen erfordert risikobasierte Strategien, wie sie beispielsweise in der FDA-Leitlinie Q9 zum Qualitätsrisikomanagement empfohlen werden. Zusätzliche Kontrollen, wie die Wareneingangsprüfung (Release Testing) eingehender Materialien und lieferantenbasierte RNase-Tests, können zur Risikominderung beitragen.

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Anforderungen an Kühlkette und Distribution

Eine weitere Herausforderung sind die Anforderungen an Kühlkette und Distribution von mRNA-Produkten. mRNA ist empfindlich gegenüber Abbau, und die Aufrechterhaltung ihrer Stabilität während Lagerung und Transport ist essenziell. Die Entwicklung stabilerer Formulierungen und Verabreichungssysteme kann dazu beitragen, diese Herausforderungen zu adressieren.

Innovationen in der mRNA-Produktion

Zukünftige Innovationen in der mRNA-Produktion könnten sich auf eine verbesserte Skalierbarkeit, Kostensenkung und eine weitere Steigerung der Produktqualität konzentrieren. Beispielsweise können die Entwicklung effizienterer Festphasen-IVT-Methoden und neuartiger Aufreinigungstechniken den Herstellprozess weiter verschlanken. Darüber hinaus können Fortschritte bei mRNA-Delivery-Systemen, wie Lipidnanopartikeln, die Stabilität und Wirksamkeit mRNA-basierter Therapien verbessern.

Empfohlene Produkte

Die Skalierung der mRNA-Produktion führt zu einer neuen Komplexitätsstufe und erfordert robuste Prozesse, hocheffiziente Workflows sowie Enzyme, die unter intensivierten Bedingungen zuverlässig funktionieren. Die spezialisierten Enzyme von Creative Enzymes sind darauf ausgelegt, die Anforderungen der großtechnischen Herstellung zu erfüllen – von der Hochdurchsatz-Linearisierung von Plasmiden über die effiziente In-vitro-Transkription bis hin zu Capping und Polyadenylierung. Durch konsistente Performance und technische Expertise unterstützen wir die skalierbare Produktion von mRNA-Therapeutika und -Impfstoffen und tragen dazu bei, globale Gesundheitsbedarfe im industriellen Maßstab zu decken. Kontaktieren Sie uns noch heute für weitere Informationen und eine individuelle Beratung.