α-Glucosidase

α-Glucosidase, auch als α-D-Glucosidase bezeichnet, ist ein Sammelbegriff für eine Enzymfamilie, die die Hydrolyse von α-Glucose vom nicht reduzierenden Ende von Substraten mit α-glycosidischen Bindungen katalysiert. Sie spaltet α-1,4-glycosidische Bindungen an den nicht reduzierenden Enden von Oligosaccharid-Substraten, setzt Glucose frei oder überträgt freie Glucosylreste auf ein anderes Kohlenhydrat-Substrat zur Bildung einer α-1,6-glycosidischen Bindung, wodurch nicht fermentierbare Isomaltooligosaccharide, Glykolipide, Glykopeptide o. Ä. entstehen. α-Glucosidase ist in der Natur in allen lebenden Organismen weit verbreitet und weist eine große Vielfalt sowie heterogene Eigenschaften auf. Seit der Identifizierung geeigneter Produktionsstämme und der industriellen Herstellung von Enzympräparaten wird α-Glucosidase u. a. zur Produktion von Isomaltooligosacchariden eingesetzt und findet auch in weiteren Anwendungsfeldern breite Beachtung in der nationalen und internationalen Lebensmittelindustrie.

Quellen

α-Glucosidase ist in der Natur weit verbreitet und kommt in nahezu allen Organismen vor. Die überwiegende Mehrheit der bislang identifizierten α-Glucosidasen stammt – abgesehen von einer kleinen Anzahl pflanzlicher und tierischer α-Glucosidasen – aus Mikroorganismen. Bestimmte Stämme wie Bakterien, Schimmelpilze und Hefen können α-Glucosidase sekretieren. Unter diesen weist Aspergillus niger besonders hohe Ausbeuten auf; die meisten am Markt verfügbaren α-Glucosidase-Produkte werden durch Fermentation von Aspergillus niger hergestellt.

Eigenschaften

Die relative Molekülmasse von α-Glucosidase liegt in der Regel zwischen 40.000 und 150.000. Sie variiert stark in Abhängigkeit von der Herkunft und unterscheidet sich teils deutlich zwischen verschiedenen Stämmen derselben Gattung oder sogar innerhalb desselben Pflanzengewebes. Der isoelektrische Punkt der bislang beschriebenen α-Glucosidasen liegt mit geringen Schwankungen im sauren Bereich, typischerweise zwischen 3,0 und 5,0; der optimale pH-Wert kann jedoch über 7,0 liegen. Viele α-Glucosidasen weisen eine hohe Thermostabilität sowie eine hohe optimale Reaktionstemperatur auf, was ihre industrielle Anwendung begünstigt. Die Thermostabilität kann mit der Aminosäurezusammensetzung zusammenhängen, insbesondere mit einem erhöhten Anteil hydrophober Aminosäuren im Enzymmolekül. Eine Zunahme hydrophober Aminosäuren wie Glycin, Alanin, Prolin und Leucin kann die Thermostabilität verbessern, möglicherweise aufgrund einer stabileren dreidimensionalen Struktur infolge verstärkter hydrophober Wechselwirkungen. α-Glucosidase gehört zu den bindungsspezifischen Enzymen und kann spezifisch α-1,4-glycosidische Bindungen in Kohlenhydrat-Substraten spalten. Einige α-Glucosidasen können zudem auf α-1,2-glycosidische Bindungen wirken. Insgesamt ist α-Glucosidase daher hinsichtlich der Substrate weniger strikt und weist ein breites Substratspektrum bzw. eine ausgeprägte Substratspezifität auf.

Katalytischer Mechanismus

α-Glucosidase hydrolysiert terminale, nicht reduzierende, (1→4)-verknüpfte α-Glucose-Reste und setzt dabei ein einzelnes α-Glucosemolekül frei. α-Glucosidase ist eine Kohlenhydrat-Hydrolase, die α-Glucose im Gegensatz zu β-Glucose freisetzt. β-Glucose-Reste können durch Glucoamylase freigesetzt werden, ein funktionell ähnliches Enzym. Die Substratselektivität der α-Glucosidase beruht auf den Affinitäten der Subsites im aktiven Zentrum des Enzyms. Zwei vorgeschlagene Mechanismen umfassen eine nukleophile Substitution sowie ein Oxocarbeniumion-Zwischenprodukt.

Metabolischer Mechanismus

α-Glucosidase umfasst hauptsächlich Enzyme wie Maltase, Sucrase, isomerisierte Maltase und Lactase, die überwiegend entlang des Bürstensaums des intestinalen Epithels lokalisiert sind und eine wichtige Rolle im Zuckerabbau spielen. Dabei werden Polysaccharide durch Speichel im Mund und durch pankreatische Amylase zu Oligosacchariden mit einer geringen Anzahl von Glucoseeinheiten verdaut; anschließend spaltet α-Glucosidase die α-1,4-glycosidischen Bindungen an den nicht reduzierenden Enden dieser Oligosaccharide und setzt Glucose frei. Die Glucose wird im Dünndarm in den Blutkreislauf aufgenommen und trägt zum Blutzuckerspiegel bei. Unter physiologischen Bedingungen ist α-Glucosidase im oberen, mittleren und unteren Abschnitt des Dünndarms vorhanden, wobei der obere Abschnitt den Hauptanteil der Resorption übernimmt.

Reinigungsverfahren

Die Ammoniumsulfat-Fällung ist ein häufig eingesetztes Verfahren zur initialen Reinigung von α-Glucosidase. Dies liegt daran, dass Ammoniumsulfat als Fällungsmittel die Enzymaktivität nur gering beeinträchtigt und der Niederschlag über längere Zeit gelagert werden kann. Gleichzeitig unterscheiden sich aufgrund der Vielfalt an Proteinstrukturen die Anfangskonzentration und die vollständige Fällungskonzentration bei der Ammoniumsulfat-Fällung, was zur groben Enzymanreicherung (Vorreinigung) und zur Entfernung des Großteils an Begleitproteinen genutzt werden kann. Die Ammoniumsulfat-Fällung ist einfach und praktikabel, jedoch ist die Trennleistung begrenzt, der Reinigungsfaktor relativ niedrig, und es verbleibt eine große Salzmenge im Enzympräparat, sodass bei der weiteren Aufreinigung eine Entsalzung erforderlich ist. Die Acetonfällung zeichnet sich durch eine höhere Trennleistung aus und ist ein weiteres gängiges Verfahren zur initialen Reinigung von α-Glucosidase. Eine direkte Fällung des Rohedenzyms mit kaltem Aceton im Volumenverhältnis von 1,0- bis 1,5-fach ist besonders geeignet und entfernt eine große Menge an Proteinverunreinigungen sowie Pigmentbestandteilen. Insbesondere bei einem Volumenverhältnis von Aceton zu Enzym von 1:2 sind Reinigungsfaktor und Ausbeute vergleichsweise hoch. Daher ist die Kombination der Salzfällung mit Ammoniumsulfat (40 %–60 %) mit der Acetonmethode für die Reinigung von α-Glucosidase besonders vorteilhaft.