P2O

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Über das Enzym

Pyranose-Oxidase (P2O, EC 1.1.3.10) ist eine flavinabhängige Oxidoreduktase der Glukose-Methanol-Cholin (GMC) Superfamilie von Oxidoreduktasen. Sie ist verantwortlich für die Oxidation von D-Glukose und anderen Monosaccharid-Substraten an der C2-Position und reduziert molekularen Sauerstoff zu Wasserstoffperoxid. P2O kommt in holzabbauenden Pilzen vor. Das von P2O produzierte Wasserstoffperoxid wird als Brennstoff für andere Enzyme betrachtet, die Lignocellulose abbauen, weshalb es auch ein Mitglied der Familie der Hilfsaktiven 3 (AA3_4) ist. Das Enzym wurde 1968 im Myzel von Spongipellis unicolor entdeckt. Die Kristallstruktur von P2O aus Pilzen kann aus der PDB abgerufen werden. Darüber hinaus wurde die Struktur vieler P2O-Varianten ebenfalls aufgeklärt.

Wie andere Mitglieder der GMC-Familie besteht P2O aus einer Flavin-bindenden Domäne und einer Substrat-bindenden Domäne. Die Flavin-bindende Domäne enthält ein βαβ-Motiv zur Bindung von Mononukleotiden und ist in den Flavoproteinen stark konserviert. Die Substrat-bindende Domäne ist das Gegenteil und zeigt mehr Sequenzvariationen, was die Präferenz für verschiedene Elektron-Donor-Substrate widerspiegelt. Das Pilz-P2O-Protein besteht aus vier identischen Monomeren, von denen jedes ein flavin-adenin-dinukleotid (FAD) enthält, das kovalent an einen Histidin-Rest im aktiven Zentrum gebunden ist. In der tetrameren Struktur von Pilz-P2O wird ein großes zentrales Hohlraum beobachtet, das mit allen vier aktiven Stellen verbunden ist. Dieser zentrale Hohlraum ist der notwendige Kanal, damit das Substrat in das aktive Zentrum eintreten kann. Die Wechselwirkungen zwischen den einzelnen Untereinheiten, die das Homo-Tetramer bilden, erfolgen durch Oligomerisierungsstrukturen, die einen Oligomerisierungsarm umfassen, der sich erstreckt, um benachbarte Untereinheiten zu umgeben, und eine Schleife, die Untereinheit-Untereinheit-Wechselwirkungen und eine kleine Domäne namens Kopfdomäne bereitstellt.

Abbildung 1. Zwei Untereinheiten der tetrameren Pyranose-Oxidase von Trametes ochracea (1TT0), die den zentralen Hohlraum (schwarzer Rahmen) zeigen, der die Eingänge der aktiven Stellen von der Außenwelt isoliert (Abrera, A.T.; et al. 2020)

Abbildung 2. Nahaufnahme des Eingangs zum Kanal, der in den inneren Hohlraum der Pyranose-Oxidase von Trametes ochracea (1TT0) führt (Abrera, A.T.; et al. 2020)

Frühere und aktuelle Verwendung in Biosensoren

Die Entwicklung von P2O-basierten Biosensoren war immer Gegenstand verwandter Forschung, einschließlich der Entdeckung neuer Enzyme, der Produktion von Varianten und der Verbesserung des Elektronentransfers, usw. Derzeit gibt es immer mehr Anwendungen von P2O-basierten Geräten zur Detektion verschiedener Biomoleküle, und sie finden Anwendung in der Lebensmittelindustrie, der Krankheitsdiagnose, der Überwachung biologischer Prozesse und dem Screening, usw. P2O, als biologischer Bestandteil für Biosensoren, wurde auf verschiedenen Arten von Elektroden, einschließlich gläsernem Kohlenstoff, Platin, Gold und Siebdruckelektroden, nachgewiesen. Es wird weiterhin auf anderen Plattformen evaluiert, um die gesamte biologische Leistung des Sensors zu verbessern. Der Grund, warum P2O als beliebter Biosensor verwendet werden kann, liegt hauptsächlich in seiner Reaktion mit Glukose. Da P2O jedoch auch andere Zucker nachweisen kann, wurde die Anwendung von P2O-basierten Biosensoren auch auf die Detektion anderer Kohlenhydrate ausgeweitet.

Ausschließlich unterschiedliche P2O von pilzlicher Herkunft wurden in diesen Biosensorstudien verwendet. In der Studie von Lidén et al. wurden P2O von P. chrysosporium (PcP2O) und Meerrettichperoxidase (HRP) auf einer Kohlenstoffpastelektrode (CPE) co-immobilisiert, wobei sowohl H₂O₂ als auch Glukose mit diesem bi-enzymatischen Biosensor nachgewiesen wurden. Das H₂O₂, das durch die Reaktion von P2O und Glukose entsteht, wird von HRP absorbiert und überträgt dann Elektronen zwischen der HRP und der Graphitelektrode. Dieser b-enzymatische Biosensor zeigt eine gute Reaktion auf verschiedene Kohlenhydrate. Viele Jahre später entwickelten Wissenschaftler P2O-basierte Biosensoren für den Einsatz in Lebensmitteln und Getränken, um verschiedene Lebensmittelverarbeitungsprozesse zu überwachen. P2O (CsP2O) von Coriolus sp. wurde erstmals zur Detektion von Glukose, Galaktose, Mannose, Xylose und Maltose eingesetzt. 

Größte Probleme des Enzyms und des Biosensors

Die Sauerstoffumsatzrate von P2O ist niedriger als die von GOx, zeigt jedoch eine beträchtliche Aktivität gegenüber Sauerstoff. Die Reduktion von Sauerstoff zu Wasserstoffperoxid im katalytischen Prozess beeinträchtigt die Empfindlichkeit, insbesondere bei niedrigen Potenzialen. Die Reaktion mit Sauerstoff ist keine erforderliche Eigenschaft für Biosensor- und BFC-Anwendungen, da sie zu Elektronenleckagen führen kann. Darüber hinaus kann H2O2 oxidative Schäden verursachen, wodurch die Enzyminaktivierung verursacht wird. Um dieses Problem zu lösen, haben Wissenschaftler erfolgreich Enzymengineering eingesetzt, um die Sauerstoffreaktivität von P2O zu modifizieren.