P2O

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Über das Enzym

Pyranoseoxidase (P2O, EC 1.1.3.10) ist eine flavinabhängige Oxidoreduktase aus der Glucose‑Methanol‑Cholin-(GMC)-Superfamilie der Oxidoreduktasen. Sie katalysiert die Oxidation von D‑Glucose und anderen Monosaccharid-Substraten an der C2‑Position und reduziert molekularen Sauerstoff zu Wasserstoffperoxid. P2O kommt in holzabbauenden Pilzen vor. Das durch P2O gebildete Wasserstoffperoxid gilt als „Treibstoff“ für weitere Enzyme, die Lignocellulose abbauen; daher wird P2O auch der Auxiliary-Activity-Familie 3 (AA3_4) zugeordnet. Das Enzym wurde 1968 im Myzel von Spongipellis unicolor entdeckt. Die Kristallstruktur der pilzlichen P2O ist in der PDB verfügbar. Darüber hinaus wurden die Strukturen zahlreicher P2O‑Varianten aufgeklärt.

Wie andere Mitglieder der GMC‑Familie besteht P2O aus einer Flavinbindungsdomäne und einer Substratbindungsdomäne. Die Flavinbindungsdomäne enthält ein βαβ‑Mononukleotid‑Bindungsmotiv und ist innerhalb der Flavoproteine hochkonserviert. Die Substratbindungsdomäne zeigt demgegenüber eine größere Sequenzvariabilität, was die Präferenz für unterschiedliche Elektronendonator‑Substrate widerspiegelt. Pilzliche P2O liegt als Tetramer aus vier identischen Monomeren vor, von denen jedes ein Flavin‑Adenin‑Dinukleotid (FAD) enthält, das im aktiven Zentrum kovalent an einen Histidinrest gebunden ist. In der tetrameren Struktur der pilzlichen P2O ist ein großer zentraler Hohlraum erkennbar, der mit allen vier aktiven Zentren verbunden ist. Dieser zentrale Hohlraum bildet den erforderlichen Kanal für den Eintritt des Substrats in das aktive Zentrum. Die Wechselwirkungen zwischen den einzelnen Untereinheiten, die das Homo‑Tetramer bilden, werden durch Oligomerisierungsstrukturen vermittelt, darunter ein Oligomerisierungsarm, der sich ausdehnt und benachbarte Untereinheiten umschließt, sowie eine Schleife, die Untereinheit‑Untereinheit‑Interaktionen bereitstellt, und eine kleine Domäne, die als Head‑Domäne bezeichnet wird.

Abbildung 1. Zwei Untereinheiten der tetrameren Pyranoseoxidase aus Trametes ochracea (1TT0) mit Darstellung des zentralen Hohlraums (schwarzer Rahmen), der die Zugänge zu den aktiven Zentren von der Außenumgebung abschirmt (Abrera, A.T.; et al. 2020)

Abbildung 2. Detailansicht des Kanaleingangs, der in den inneren Hohlraum der Pyranoseoxidase aus Trametes ochracea (1TT0) führt (Abrera, A.T.; et al. 2020)

Frühere und aktuelle Verwendung in Biosensoren

Die Entwicklung von P2O‑basierten Biosensoren ist seit jeher Gegenstand einschlägiger Forschung, einschließlich der Identifizierung neuartiger Enzyme, der Herstellung von Varianten sowie der Verbesserung des Elektronentransfers, etc. Derzeit gibt es zunehmend Anwendungen P2O‑basierter Systeme zur Detektion verschiedener Biomoleküle, u. a. in der Lebensmittelindustrie, der Krankheitsdiagnostik sowie im Monitoring und Screening biologischer Prozesse, etc. P2O als biologische Komponente eines Biosensors wurde auf unterschiedlichen Elektrodenarten validiert, darunter Glaskohlenstoff‑, Platin‑, Gold‑ und Siebdruckelektroden. Die Evaluierung auf weiteren Plattformen zur Verbesserung der Gesamtleistung des Sensors wird fortgeführt. Der Grund, weshalb P2O als verbreitete Biosensor‑Komponente eingesetzt werden kann, liegt vor allem in ihrer Reaktion mit Glucose. Da P2O jedoch auch andere Zucker detektieren kann, wurde das Anwendungsspektrum P2O‑basierter Biosensoren auf die Bestimmung weiterer Kohlenhydrate erweitert.

In diesen Biosensor‑Studien wurden ausschließlich unterschiedliche P2O‑Enzyme pilzlichen Ursprungs eingesetzt. In der Studie von Lidén et al. wurden P2O aus P. chrysosporium (PcP2O) und Meerrettichperoxidase (HRP) gemeinsam auf einer Kohlenstoffpasten‑Elektrode (CPE) co‑immobilisiert; mit diesem bi‑enzymatischen Biosensor wurden sowohl H₂O₂ als auch Glucose detektiert. Das durch die Reaktion von P2O mit Glucose gebildete H₂O₂ wird von HRP umgesetzt und ermöglicht anschließend den Elektronentransfer zwischen HRP und der Graphit‑Elektrode. Dieser bi‑enzymatische Biosensor zeigt eine gute Ansprechbarkeit gegenüber verschiedenen Kohlenhydraten. Viele Jahre später entwickelten Wissenschaftler P2O‑basierte Biosensoren für den Einsatz in Lebensmitteln und Getränken zur Überwachung verschiedener Lebensmittelverarbeitungsprozesse. P2O (CsP2O) aus Coriolus sp., immobilisiert auf einer Kohlenstoffpasten‑Elektrode, wurde erstmals zur Detektion von Glucose, Galactose, Mannose, Xylose und Maltose eingesetzt. 

Größte Probleme des Enzyms und des Biosensors

Die Sauerstoff‑Umsatzrate von P2O ist niedriger als die von GOx, jedoch weist P2O eine erhebliche Aktivität gegenüber Sauerstoff auf. Die Reduktion von Sauerstoff zu Wasserstoffperoxid während des katalytischen Prozesses kann die Sensitivität beeinträchtigen, insbesondere bei niedrigen Potenzialen. Die Reaktion mit Sauerstoff ist für Biosensor‑ und BFC‑Anwendungen keine erforderliche Eigenschaft, da sie zu Elektronenleckage führen kann. Zudem kann H₂O₂ oxidative Schäden verursachen und dadurch eine Enzyminaktivierung auslösen. Zur Lösung dieses Problems wurde die Sauerstoffreaktivität von P2O erfolgreich mittels Enzymengineering modifiziert.