AlaDH

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Alanin-Dehydrogenase (AlaDH) wird derzeit in verschiedenen Anwendungsbereichen wie Biotechnologie, Lebensmittelindustrie und Pharmazie eingesetzt. Der systematische Name der AlaDH (EC 1.4.1.1) lautet L‑Alanin:NAD⁺-Oxidoreduktase (Desaminierung). Sie gehört zur Klasse der Oxidoreduktasen, da sie im Rahmen der oxidativen Desaminierung den Elektronenakzeptor NAD⁺/NADP⁺ reduziert. AlaDH wurde erstmals von Wiame und Pierard in Bacillus subtilis beschrieben. In der Folge wurden die kinetischen Eigenschaften sowie die geschwindigkeitsbestimmenden katalytischen Schritte des Enzyms in verschiedenen Mikroorganismen publiziert. Die Alanin-Dehydrogenase unterscheidet sich von der Glutamat-Dehydrogenase dadurch, dass sie in Mikroorganismen nicht ubiquitär gebildet wird, sondern überwiegend in Bacillus-Spezies vorkommt.

Das für AlaDH kodierende Gen wird als ald (alaD) bezeichnet. Das ald-Gen von M. tuberculosis weist bei Expression in E. coli eine Pyruvat-aminierende Aktivität auf. Wird das ald-Gen in M. tuberculosis jedoch inaktiviert, führt dies zum Verlust der AlaDH-Funktion. In B. subtilis ist aldR ein transkriptioneller Aktivator, der die ald-Expression vermittelt und für die Sporulation von Bedeutung ist. In Rhizobium leguminosarum verhindern Mutationen in aldR die Induktion der ald-Aktivität. Somit ist aldR für die Induktion des ald-Gens erforderlich; abhängig von der Anwesenheit oder Abwesenheit von L‑Alanin kann aldR als Aktivator oder als Repressor fungieren. Mittels DNase‑I‑Footprint-Analyse wurden vier aldR‑Bindestellen (O2, O1, O4 und O3) 95 bp stromaufwärts des ald-Gens von M. smegmatis identifiziert. O2, O1 und O4 sind für die alaninabhängige Induktion der ald-Expression erforderlich, während O3 direkt an der Hemmung der ald-Expression beteiligt ist. Studien zeigen, dass der Transkriptionsregulator aldR in Anwesenheit von Alanin seine Quartärstruktur von einem Homodimer zu einem Oktamer mit offener Ringkonformation verändert.

Abbildung 1. Von AlaDH katalysierte Vorwärts- und Rückwärtsreaktion (Dave, U.C; Kadeppagari, R.K. 2019)

Aktivität der oxidativen Desaminierung

AlaDH katalysiert in der Vorwärtsreaktion die Abspaltung von Aminogruppen aus L‑Alanin; das dabei entstehende Kohlenstoffgerüst (Pyruvat) kann anschließend über den Citratzyklus abgebaut werden. Die Funktion von AlaDH besteht darin, Pyruvat als Energiequelle bereitzustellen, die für die Sporulation erforderlich ist.

Aktivität der reduktiven Aminierung

Assimiliertes Pyruvat und Ammonium werden durch AlaDH zu L‑Alanin umgesetzt. Die Hauptfunktion von AlaDH in vivo ist die reduktive Aminierung von Pyruvat, wodurch Alanin zur Synthese von Peptidoglykan bereitgestellt wird. AlaDH spielt eine wichtige Rolle bei der Synthese des Zellwandgerüsts von Mikroorganismen (z. B. Streptomyces aureofaciens), da L‑Alanin eine der drei essenziellen Aminosäuren ist, die die repetitiven Peptid-Untereinheiten des Peptidoglykans bilden. Da L‑Alanin zudem in vielen bekannten, biologisch relevanten Proteinen häufig vorkommt, ist es auch für die Proteinsynthese im bakteriellen Zytoplasma von Bedeutung.

Abbildung 2. Funktion von AlaDH in Mikroorganismen durch oxidative Desaminierung von L‑Alanin in der Vorwärtsreaktion und reduktive Aminierung von Pyruvat in der Rückwärtsreaktion (Dave, U.C; Kadeppagari, R.K. 2019)

Aufrechterhaltung von NAD⁺/NADH

AlaDH spielt zudem eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung des NAD⁺-Pools. Der ald-Knockout-Mutant von M. tuberculosis zeigte in vitro keine reduzierte anaerobe Überlebensfähigkeit, verursachte jedoch eine signifikante Verzögerung bei der Wiederaufnahme des Wachstums nach Reoxygenierung. Während des Reaktivierungsprozesses veränderte sich das NADH/NAD⁺-Verhältnis des Mutanten, was darauf hindeutet, dass AlaDH erforderlich ist, um während der Anaerobiose ein optimales NADH/NAD⁺-Verhältnis aufrechtzuerhalten. AlaDH stabilisiert das Redoxgleichgewicht (NADH/NAD⁺) in M. tuberculosis während Dormanz/Hypoxie und ermöglicht die Wiederherstellung/Reaktivierung, sobald der Sauerstoffgehalt ausreichend ansteigt, um die Regeneration von M. tuberculosis zu unterstützen.

Glyoxylat-reduktive-Aminase-Aktivität

Darüber hinaus kodiert ald in einigen Mikroorganismen eine bifunktionale AlaDH. Die PvRA (Pyruvat-reduktive-Aminase-Aktivität) katalysiert die Reduktion von Pyruvat zu Alanin, und die GxRA (Glyoxylat-reduktive-Aminase-Aktivität) katalysiert die Umsetzung von Glyoxylsäure zu Glycin unter Oxidation von NADH zu NAD⁺. AlaDH wurde in zahlreichen Bakterienarten identifiziert; jedoch besitzen nicht alle diese Enzyme eine GxRA-Aktivität, was möglicherweise auf die ausgeprägte Sequenzdiversität dieser Enzyme zurückzuführen ist. Die duale Funktion von AlaDH in Mycobacterium tuberculosis wurde mittels biochemischer und genetischer Methoden nachgewiesen. Die Inaktivierung von ald in M. tuberculosis führt zu einer Abnahme oder einem Verlust sowohl der PvRA- als auch der GxRA-Aktivität. Die Funktion wurde wiederhergestellt, nachdem eine klonierte Kopie von ald in das Genom inseriert worden war. Darüber hinaus katalysiert ein aus E. coli gereinigtes, Histidin-markiertes Protein unter Verwendung von Pyruvat oder Glyoxylat als Substrat beide Reaktionen.

Abbildung 3. Von AlaDH katalysierte Reaktionen (Dave, U.C; Kadeppagari, R.K. 2019)