AlaDH

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Alanindehydrogenase (AlaDH) wird derzeit in verschiedenen Anwendungen wie Biotechnologie, Lebensmittel und Pharmazie eingesetzt. Der systematische Name von AlaDH (EC1.4.1.1) ist L-Alanin: NAD⁺ Oxidoreduktase (Deaminierung), die zu den Oxidoreduktasen gehört, da sie einen Elektronenakzeptor NAD⁺/NADP⁺ im Prozess der oxidativen Deaminierung reduziert. AlaDH wurde erstmals von Wiame und Pierard in Bacillus subtilis entdeckt. Anschließend wurden die kinetischen Eigenschaften und die katalytischen Limitierungsschritte des Enzyms in verschiedenen Mikroorganismen veröffentlicht. Alanindehydrogenase unterscheidet sich von Glutamatdehydrogenase, da sie nicht häufig in Mikroorganismen produziert wird, sondern hauptsächlich in Bacillus-Arten vorkommt.

Das Gen, das AlaDH kodiert, wird ald (alaD) genannt. Das ald-Gen von M. tuberculosis hat pyruvataminierende Aktivität, wenn es in E. coli exprimiert wird. Wenn jedoch das ald-Gen in M. tuberculosis inaktiviert wird, führt dies zum Verlust der AlaDH-Funktion. In B. subtilis ist aldR ein Transkriptionsaktivator, der die ald-Expression vermitteln kann und wichtig für die Sporulation ist. In Rhizobium leguminosarum verhindern Mutationen in aldR die Induktion der ald-Aktivität. Daher ist aldR notwendig für die Induktion des ald-Gens, und aldR kann je nach Vorhandensein oder Abwesenheit von L-Alanin entweder als Aktivator oder Repressor fungieren. Durch DNase I-Footprint-Analyse wurden vier aldR-Bindungsstellen (O2, O1, O4 und O3) 95 bp stromaufwärts des ald-Gens von M.smegmatis identifiziert. O2, O1 und O4 sind erforderlich für die Induktion der ald-Expression durch Alanin, und O3 beteiligt sich direkt an der Hemmung der ald-Expression. Studien haben gezeigt, dass sich der Transkriptionsregulator aldR in Gegenwart von Alanin von einem Homodimer in ein Oktamer mit einer offenen Ringkonformation ändert.

Abbildung 1. AlaDH-katalysierte Vorwärts- und Rückreaktion (Dave, U.C; Kadeppagari, R.K. 2019)

Oxidative Deaminierungsaktivität

AlaDH katalysiert die Entfernung von Aminogruppen aus L-Alanin in einer Vorwärtsreaktion, die dann das Kohlenstoffgerüst (Pyruvat) durch den Zitronensäurezyklus abbauen kann. Die Rolle von AlaDH besteht darin, Pyruvat als Energiequelle bereitzustellen, die für die Sporulation notwendig ist.

Reduktive Aminierungsaktivität

Pyruvat und assimiliertes Ammonium werden von AlaDH zu L-Alanin metabolisiert. Die Hauptfunktion von AlaDH in vivo ist die reduzierte Aminierung von Pyruvat, die zur Produktion von Alanin verwendet werden kann, um Peptidoglycan zu synthetisieren. AlaDH spielt eine wichtige Rolle bei der Synthese der Zellwandgerüste von Mikroorganismen (wie Streptomyces aureofaciens), da L-Alanin eine der drei essentiellen Aminosäuren ist, die die sich wiederholenden Peptiduntereinheiten des Peptidoglycans bilden. Da L-Alanin häufig in vielen wichtigen bekannten Proteinen vorkommt, spielt es auch eine wichtige Rolle bei der Proteinsynthese im bakteriellen Zytoplasma.

Abbildung 2. Funktion von AlaDH in Mikroorganismen durch oxidative Deaminierung von L-Alanin in Vorwärtsreaktion und reduzierte Aminierung von Pyruvat in Rückreaktionen (Dave, U.C; Kadeppagari, R.K. 2019)

NAD⁺/NADH-Erhaltung

AlaDH spielt auch eine wichtige Rolle bei der Erhaltung des NAD⁺-Pools. Der ald-Knockout-Mutant von M. tuberculosis reduzierte nicht das anaerobe Überleben in vitro, führte jedoch zu einer signifikanten Verzögerung bei der Wiederaufnahme des Wachstums nach der Reoxygenierung. Während des Reaktivierungsprozesses änderte sich das NADH/NAD⁺-Verhältnis des Mutanten, was darauf hinweist, dass AlaDH benötigt wird, um das optimale NADH/NAD⁺-Verhältnis während der Anaerobiose aufrechtzuerhalten. AlaDH erhält das Redox-Gleichgewicht (NADH/NAD⁺) in M. tuberculosis während der Dormanz/Hypoxie und stellt es wieder her/reaktiviert es, wenn der Sauerstoffgehalt ausreichend erhöht wird, um die Regeneration von M. tuberculosis zu unterstützen.

Glyoxylat-reduktive Aminase-Aktivität

Zusätzlich kodiert ald eine bifunktionale AlaDH in einigen Mikroorganismen. PvRA (pyruvat-reduktive Aminase-Aktivität) katalysiert die Reduktion von Pyruvat zu Alanin und GxRA (Glyoxylat-reduktive Aminase-Aktivität) katalysiert Glyoxylsäure zu Glycin und oxidiert NADH zu NAD+. AlaDH wurde aus vielen Arten von Bakterien identifiziert, aber nicht alle diese Enzyme haben GxRA-Aktivität, was auf die Existenz einer großen Sequenzvielfalt in diesen Enzymen zurückzuführen sein könnte. Die duale Funktion von AlaDH in Mycobacterium tuberculosis wurde durch biochemische und genetische Methoden bestimmt. Die Inaktivierung von ald in M. tuberculosis führt zu einer Abnahme oder zum Verlust der Aktivität sowohl von PvRA als auch von GxRA. Die Funktion wurde wiederhergestellt, als die klonierte Kopie von ald dann in das Genom eingefügt wurde. Darüber hinaus katalysiert ein histidinmarkiertes Protein, das aus E. coli gereinigt wurde, unter Verwendung von Pyruvat oder Glyoxylat als Substrat diese beiden Reaktionen.

Abbildung 3. Von AlaDH katalysierte Reaktionen (Dave, U.C; Kadeppagari, R.K. 2019)