Enzymexpression und -produktion

Creative Enzymes bietet maßgeschneiderte Dienstleistungen für die Expression und Produktion sowohl natürlicher als auch rekombinanter Enzyme in verschiedenen Systemen an. Mit dem Fortschritt des Verständnisses von Enzymologie und Molekularbiologie haben sich Enzyme als immer wichtiger in fast allen biologischen Wegen erwiesen. Derzeit sind über 200 proteinbasierte Arzneimittel von der FDA lizenziert. Der Umsatz mit therapeutischen Enzymen und industriellen Enzymen summierte sich bis 2010 auf über 6 Milliarden US-Dollar. Das schnelle Wachstum des Marktes und die Produktentwicklung erfordern Dienstleistungen für die großtechnische Produktion. Inzwischen werden neue Enzyme entwickelt, um alle Arten von Bedürfnissen in der Pharmazie und Katalyse zu erfüllen. Eine fortschrittliche Expression von Enzymen mit speziellen Eigenschaften und Funktionen wird von allen Forschern gewünscht. Creative Enzymes hat Expressionssysteme für alle Arten von Enzymen etabliert und entwickelt, die die frühen Phasen der cDNA-Vorbereitung, DNA-Klonierung, Enzymexpression bis hin zur Produktionsskalierung abdecken. Unsere herausragenden Wissenschaftler und strategischen Partner kümmern sich professionell um jedes Detail jedes Schrittes. Wir sind die Experten, denen Sie im gesamten Prozess der Enzymexpression vertrauen können.

Mehrere Schritte sind erforderlich, um ein natürliches oder rekombinantes Enzym zu erhalten, abhängig von der Quelle der Gensequenz und den spezifischen technischen Anforderungen: Die anfängliche cDNA-Synthese, Amplifikation und Isolation; gefolgt von der Einfügung in einen Vektor; und schließlich Induktion und Expression des Zielenzym (Abbildung 1). Die ersten beiden Schritte werden auch normalerweise als cDNA-Klonierung betrachtet. Ein gewünschtes Enzym könnte ein natürliches Enzym sein, das in bestimmten Zellen zu einem bestimmten Zeitpunkt in hoher Menge vorhanden ist, was im Allgemeinen mit einer hohen Menge der entsprechenden mRNA zusammenhängt. Daher kann die mRNA identifiziert und isoliert werden, um als Vorlage für die reversen Transkription zur Erzeugung von cDNA verwendet zu werden, die komplementär zur mRNA-Sequenz ist und keine Introns oder Operons enthält. Alternativ, wenn die kodierende Sequenz des Enzyms bekannt ist, ist die vollständige Synthese von cDNA manchmal ein schnellerer und wirtschaftlicherer Ansatz. Nach dem Erhalt der Ziel-cDNA wird die Amplifikation der cDNA-Kopien durchgeführt. Traditionell wird eine cDNA-Kopie in einen Vektor eingefügt und Wirtszellen werden verwendet, um die Vektor-DNA, auch bekannt als rekombinante DNA, zusammen mit der DNA der Wirtszellen zu vervielfältigen. Die anschließende Isolation und Reinigung liefert die Ziel-cDNA in großer Menge. Allerdings sind in diesem Prozess mehrere Schritte des Schneidens und Ligierens sowie der Reinigung von DNA erforderlich, was zu hohen Kosten und geringer Effizienz führt. Daher hat die PCR (Polymerase-Kettenreaktion) Technologie die cDNA-Klonierung revolutioniert, seit sie erfunden wurde. Die Technologie macht die DNA-Klonierung sowohl für bestimmte DNA-Klone als auch für den Aufbau einer cDNA-Bibliothek viel schneller und einfacher. Mit der jüngsten Entwicklung der Technologie, wie qPCR (quantitative PCR) und RT-PCR (reverse Transkriptions-PCR), ist sie zu einem der am häufigsten verwendeten und oft unverzichtbaren Werkzeuge in der cDNA-Klonierung geworden.

Abbildung 1. Ein Schema der vereinfachten cDNA-Klonierung und -expression.

Um ein rekombinantes Enzym aus der cDNA-Kopie zu produzieren, muss ein Expressionsvektor ausgewählt werden, wobei die Wahl des geeigneten Expressionswirts, der zum Vektor passt, berücksichtigt werden muss. Obwohl bei der Auswahl von Expressionsvektoren keine spezifische Priorität gegeben wird, sollten mehrere Schlüsselfaktoren berücksichtigt werden. Erstens muss der ausgewählte Vektor eine hohe Plasmidstabilität während der Fermentation aufweisen. Zweitens sollte der Replikationsursprung die Produktion einer hohen Kopienzahl des Plasmids gewährleisten, was auch für die großtechnische Produktion wichtig ist. Als Nächstes sollte der Vektor mehrere Klonierungsstellen oder einen Klonierungsbereich enthalten, in den die Ziel-DNA leicht ligiert werden kann. Darüber hinaus sollten auch die Transkriptionspromotoren und Fusions-Tags bei der Auswahl des Vektors berücksichtigt werden. Alternativ bietet Creative Enzymes auch Auto-Induktionsmedien an, die während der Fermentation nur wenig menschliches Eingreifen erfordern. Die Technologie basiert auf der metabolischen Kontrolle von E. coli und führt automatisch einen Wechsel von Wachstum zur Expression rekombinanter Proteine zum richtigen Zeitpunkt durch. Die Vorteile sind ideal für die großtechnische Produktion rekombinanter Enzyme.

Wenn es um Expressionswirte geht, stehen eine Vielzahl von Protein-Expressionssystemen zur Verfügung. Enzyme können in Zellkulturen von Bakterien, Hefen, Schimmelpilzen, Säugetieren, Pflanzen oder Insekten oder über transgene Pflanzen und Tiere exprimiert werden. Bei der Auswahl des Expressionssystems sind die Proteinqualität, Funktionalität, Produktionsgeschwindigkeit und -ausbeute die wichtigsten Faktoren, die berücksichtigt werden müssen. Nicht-glykosylierte Proteine werden normalerweise in E. coli oder Hefen, den häufigsten Expressionssystemen, hergestellt. N-glykosylierte Proteine werden normalerweise in Säugetierzellen produziert, die die menschliche Glykosylierung nachahmen, was besonders wichtig für therapeutische Enzyme ist. Zum Beispiel wird etwa die Hälfte des Marktes für therapeutische Proteine von chinesischen Hamster-Ovarien (CHO) Zellen bereitgestellt. Der Prozess ist jedoch teuer und die Glykoproteine könnten immer noch von der menschlichen Art abweichen und benötigen daher manchmal eine weitere Modifikation. Hefen, Schimmelpilze und Insektenzellen werden ebenfalls genetisch verändert, um eine menschliche Art der Glykosylierung zu produzieren. Im Allgemeinen sind Bakterien und Hefen die am weitesten entwickelten Systeme, was kostengünstige Expression und Produktion bedeutet; während höhere Organismen teurer zu betreiben sind, aber auch die Fähigkeit bieten, komplexere Enzyme zu produzieren (Abbildung 2). Bei Creative Enzymes empfehlen wir immer, zunächst einen E. coli Stamm auszuprobieren, aufgrund ihrer Fähigkeit, schnell und in hoher Dichte zu wachsen, niedrigen Kosten und hoher Produktivität. Wenn der Forscher jedoch auf eines der Nachteile des Systems stößt, wie die Bildung von Einschlusskörperchen, falsches Protein-Falten und den Abbau des heterologen Proteins, insbesondere wenn das heterologe Enzym ursprünglich aus Prokaryoten isoliert wurde, sollten andere Expressionssysteme, wie Hefe-, Insekten- und Säugetiersysteme, in Betracht gezogen werden.

Abbildung 2. Vorteile typischer Wirte für die Enzymexpression.

Mit jahrzehntelanger Erfahrung in Klonierung und Expression bietet Creative Enzymes mehrere einzigartige und fortschrittliche Lösungen für viele Arten von Enzymen an. Wie man von den zuvor genannten Schlüsselpunkten zur Auswahl des Expressionssystems erwarten könnte, hängt die Wahl des am besten geeigneten Systems für ein Enzym stark von der Erfahrung des Forschers sowie von einer gründlichen Berücksichtigung der Enzymeigenschaften ab. Daher ermutigen wir die Kunden, so viele Details wie möglich bei der Einreichung der Serviceanfrage zu teilen. Mit vielen Jahren hervorragendem Service auf dem globalen Markt sind wir überzeugt, dass Sie mit den professionellen und produktiven Dienstleistungen voll zufrieden sein werden. Bitte zögern Sie nicht, uns für ein Angebot unserer Expressions- und expressionsbezogenen Dienstleistungen zu kontaktieren:

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