Enzymreinigung durch Affinitätschromatographie für markierte Enzyme

Creative Enzymes bietet die maßgeschneiderte Produktion von rekombinanten Enzymen für die Laborforschung und industrielle Anwendungen an. Mit dem starken technischen Hintergrund in der Enzymherstellung und molekularbiologischen Techniken sind verschiedene Nachbearbeitungsdienste verfügbar, um reine, stabile Enzyme zu gewinnen. Creative Enzymes bietet zuverlässige Reinigungsdienste an, um nachfolgende Anwendungen mit kontaminationsfreien Enzymen zu erleichtern.

Die parallele Verwendung von Affinitätsmarkern mit rekombinanten DNA-Techniken ermöglicht die einfache Modifikation von Zielproteinen, was zu einer effizienten Identifizierung, Produktion und Isolation aus dem Wirtsystem führt. Allerdings sind Proteinunlöslichkeit, Konformation, Stabilität und strukturelle Flexibilität sowie niedrige Reinigungsausbeuten und Toxizität der Wirtszellen Herausforderungen, die gelöst werden müssen, wenn mikrobielle Wirte zur Expression rekombinanter Proteine verwendet werden. Um diese Herausforderungen in Bezug auf Produktions- und Reinigungseffizienz anzugehen, werden Fusionsmarker integriert, um die Expressionserträge zu erhöhen und die Löslichkeit sowie die native Faltung zu beeinflussen; neuartige Marker in Kombination mit Affinitäts-Techniken erhöhen die Reinigungsausbeuten; und Proteasen führen zur Entfernung der Marker. Die am häufigsten verwendeten Marker in der Enzymreinigung sind His-Tag und GST-Tag. Die markierten Enzyme werden durch Affinitätschromatographie isoliert und getrennt.

• His-Tag

His-Tag ist ein kurzer Affinitätsmarker, der aus Polyhistidin-Resten besteht. Es ist eine weit verbreitete Methode im Reinigungsprozess durch immobilisierte Metall-Affinitätschromatographie (IMAC). Das grundlegende Prinzip ist die Wechselwirkung zwischen einem Übergangsmetallion, das auf einer Matrix immobilisiert ist, und spezifischen Aminosäure-Seitenketten. Der Imidazolring der Histidinreste kann als Elektronendonator wirken und Koordinationsbindungen mit dem immobilisierten Übergangsmetall bilden, daher ist die Wechselwirkung sehr stark. Wenn das rohe Enzym durch die Matrizen fließt, werden Enzyme, die Histidinreste enthalten, effizient auf den IMAC-Säulenmatrizen zurückgehalten. Bei Creative Enzymes wurde His-Tag erfolgreich zur Reinigung von Enzymen aus vielen Expressionssystemen verwendet. Dieser Reinigungsansatz führt zu 100-facher Anreicherung in einem einzigen Reinigungsschritt. Die Enzymreinheit kann bis zu 95% mit einer hohen Ausbeute betragen.

Abbildung: Das Schema zum Hinzufügen eines His-Tags zum Zielprotein unter Verwendung eines Primers, der den Tag enthält.

• GST-Tag

Glutathion S-Transferase (GST) ist ein 26 kDa Protein. Es wurde für die Ein-Schritt-Reinigung von Fusionsproteinen verwendet. Aufgrund der spezifischen Bindung an Glutathion, das an eine Sepharose-Matrix gekoppelt ist, werden die interessierenden Enzyme, die mit der GST-Einheit fusioniert sind, während des Reinigungsprozesses auf den Säulenmatrizen zurückgehalten. Unter milden, nicht denaturierenden Bedingungen können die Zielenzyme durch Zugabe von reduziertem Glutathion zum Elutionspuffer freigesetzt werden. Creative Enzymes hat detaillierte Protokolle für die erfolgreiche Reinigung verschiedener mit GST fusionierter Enzyme gut entwickelt und optimiert. Unser Reinigungsprozess erhält die Löslichkeit des Fusionsproteins und vermeidet Denaturierungsmittel oder milde Detergenzien während der Reinigung.

• Immunaffinitätschromatographie (IAC)

Das Prinzip der IAC ist die Nutzung der hohen Spezifität zwischen Antikörper und Antigen. IAC ist anderen Chromatographiemethoden überlegen, wenn die Enzymkonzentration in Mischungen sehr niedrig ist. Durch die Kopplung des Antikörpers an die geeigneten Harze zur Bildung eines Affinitätsadsorbens können die gezielten Enzyme in der Fermentationsmatrix effizient isoliert und gereinigt werden. Obwohl die Elutionsprozesse aufgrund der starken Affinitäten schwierig sein können, hat Creative Enzymes einzigartige Techniken entwickelt, um eine effiziente Elution zu erreichen.

Als unverzichtbare Werkzeuge zur Erreichung der Proteinreinigung ist die Affinitätschromatographie die am weitesten verbreitete Methode in der biologischen Forschung. Creative Enzymes bietet zuverlässige Reinigungsdienste an. Die gereinigten Enzyme sind von hoher Reinheit und Stabilität. Unser Ziel ist es, die beste Qualität zu erreichen, ohne die Servicekosten zu erhöhen. Bitte kontaktieren Sie uns für Details und weitere Vorteile unseres Services.