Enzymreinigung durch Immunpräzipitation

Creative Enzymes unterstützt Forscher aus verschiedenen Branchen mit hochwertigen Produkten und Dienstleistungen. Basierend auf jahrzehntelanger Entwicklung unserer einzigartigen Techniken bieten wir zuverlässige Enzymreinigungsdienste mit einer breiten Palette verfügbarer Methoden an. Die Immunpräzipitation (IP) ist eine der effizientesten Methoden zur Isolierung von Enzymen und Enzymkomplexen. Unsere Dienstleistungen umfassen das Design, die Standardoperationen und die Qualitätsinspektion.

Immunpräzipitation ist eine Methode zur Isolierung kleiner Mengen des Zielproteins aus komplexen Proben wie Zelllysaten, Serum und Gewebehomogenaten. Die in der IP verwendeten Antikörper können polyklonal oder monoklonal sein und können das interessierende Enzym, eine bestimmte posttranslationalen Modifikation oder ein Epitop-Tag erkennen, wenn das Protein überexprimiert wird. Es gibt drei weit verbreitete Methoden der Immunpräzipitation.

• Die traditionelle (oder klassische) Methode

In der traditionellen Methode werden die Antikörper zunächst mit der Probe, die das Zielenzym (Antigen) enthält, inkubiert. Nachdem der Antigen-Antikörper-Komplex gebildet wurde, wird er an Protein A- oder Protein G-Perlen gebunden, die typischerweise quervernetztes Agarose sind. Anschließend werden die Perlen und die Probe zentrifugiert, um den gefangenen Immunkomplex zu pelletieren. Zu den Problemen dieser Reinigungsmethode gehören die Kontamination des Zielproteins mit dem IP-Antikörper, die Zerstörung des kostspieligen IP-Antikörpers und der Probenverlust, der beim Pipettieren oder Entfernen von Überständen aus kleinen Harzpellets entsteht. Darüber hinaus ist die Kontamination am problematischsten, wenn das Antigen oder sein interagierender Partner ähnliche Molekulargewichte wie die schweren und leichten Ketten des Antikörpers aufweist, da diese Banden in SDS-PAGE ko-migrieren.

• Orientierte Affinitätsmethode

Diese Methode ermöglicht die Vernetzung des Antikörpers mit Protein A- oder G-Perlen, was zu einem permanenten Affinitätsunterstützung führt, bei der der Antikörper richtig orientiert ist, um das Zielantigen zu binden. Diese Methode ist vorzuziehen, wenn die Menge des Antikörpers begrenzt oder teuer ist, da das Antikörper: Protein A- oder G-Harz wiederverwendet werden kann.

• Direkte Affinitätsmethode

In dieser Methode wird der Antikörper direkt an die Agarose-Perlen gekoppelt, wodurch die Notwendigkeit eines Linkers oder von Protein A oder G entfällt. Diese Methode ist besonders vorteilhaft, wenn Antikörper verwendet werden, die nicht stark an Protein A oder G binden. Diese direkte Affinitätsstrategie führt jedoch zu einer zufälligen Orientierung des Antikörpers auf den Perlen. Dies kann wahrscheinlich zu einer Verringerung der Antikörperbindungsfähigkeit unter bestimmten Bedingungen führen. Der Vorteil der direkten Affinitätsmethode besteht darin, dass die eluierten Fraktionen nicht mit den schweren und leichten Ketten des Antikörpers kontaminiert sind und das Harz mehrere Male wiederverwendet werden kann.

Abbildung 1: Die Strategien zur Vorbereitung von Immunpräzipitationsmatrizen.

Abbildung 2: Vergleich der Antigenbindungsfähigkeit der drei IP-Methoden.

Verschiedene Faktoren können den Reinigungsprozess beeinflussen, einschließlich der Klasse des IP-Antikörpers, der Eigenschaften des gereinigten Proteins sowie der Verfügbarkeit und Kosten des Antikörpers. Creative Enzymes berücksichtigt diese Faktoren umfassend. Wir bewerten die Reinigungsstrategie, bevor wir den Reinigungsprozess durchführen, um sicherzustellen, dass das am besten geeignete Protokoll für jedes Enzym verwendet wird. Unser technisches Team ist versiert in der Etablierung geeigneter Methoden und der Durchführung zuverlässiger Operationen, um die hohe Qualität der Reinigungsdienste sicherzustellen. Dieser maßgeschneiderte Service wird die Forschung und Kommerzialisierung in allen Arten von Enzymanwendungen beschleunigen.