Enzymwiedergewinnung und Refolding

Creative Enzymes ist ein führendes Unternehmen in der Entwicklung, Herstellung und Prüfung zahlreicher Enzyme. Viele fortschrittliche Enzym-Expressions- und insbesondere kundenorientierte Enzymreinigungsdienste stehen allen industriellen und akademischen Kunden zur Verfügung. Wir bieten vollständig maßgeschneiderte Dienstleistungen zur Reinigung der Zielenzyme an. Die Rückgewinnung und das Refolding nach der Reinigung sind einer der einzigartigen Dienste von Creative Enzymes, der ein wichtiger Teil der Reinigung ist und die Gesamtertragsausbeute erheblich verbessern kann.

Die rekombinante Enzym-Expressions-Technologie wird weit verbreitet eingesetzt. Heterologe Genexpression führt häufig zur Produktion von Einschlusskörperchen. Das Refolding von Enzymen in die native Konformation aus einem denaturierten Zustand, wie in Einschlusskörperchen, ist ein begrenzender Schritt bei der Rückgewinnung aktiver Enzyme. Die Aggregation von Enzymen ist ein häufiges Vorkommen, das zu niedrigen Rückgewinnungsraten führt. Creative Enzymes verwendet mehrere Techniken, um das korrekte Refolding zu erreichen:

• Direkte Verdünnung

Die einfachste Methode zum Refolding von Enzymen besteht darin, die konzentrierte Enzym-Denaturant-Lösung in einen Refolding-Puffer zu verdünnen, der die Bildung der nativen Struktur des Enzyms ermöglicht. Obwohl ideal im Labormaßstab, hat diese Methode ernsthafte Nachteile bei der Skalierung, da riesige Refolding-Behälter und zusätzliche kostenintensive Konzentrationsschritte nach der Renaturierung erforderlich sind.

Abbildung 1: Vereinfachtes Modell des korrekten Faltens versus Fehlfaltung und Aggregation. Der korrekte Faltungsweg des Enzyms (dargestellt als 1) konkurriert häufig mit Fehlfaltung (dargestellt als 2) und Aggregation (dargestellt als 3). Blaue Linien stehen für die hydrophilen, lösungsmittel-exponierten Teile des Proteins; rote Linien stehen für die hydrophoben Bereiche.
Referenz: Vallejo F L, Rinas U. Microbial Cell Factories, 2004, 3(1):1-12.

• Dialyse

Bei der Dialyse wird das chemisch denaturierte Enzym refoldiert, um die Denaturantkonzentration ausreichend zu verringern und das Refolding des Enzyms zu ermöglichen. Die Ein-Schritt-Dialyse ist einfach zu bedienen. Die Methode ist jedoch manchmal nicht für großtechnische Anwendungen geeignet.

Abbildung 2: Schematische Darstellung der beiden Arten von Dialyseverfahren zur Entfernung von Denaturanten aus denaturierten Proteinlösungen. Bei der Ein-Schritt-Dialyse verringert sich die Denaturantkonzentration um das Protein herum schnell durch Diffusion, was zu Aggregaten führt. Bei der schrittweisen Dialyse erfolgt die schrittweise Entfernung des Denaturanten aus den denaturierten Proteinen.
Referenz: Yamaguchi H, Miyazaki M. Biomolecules, 2014, 4(1):235-251.

• Chromatographische Methoden zum Enzym-Refolding

a. Adsorptionschromatographie (SEC, HIC, IEC, IMAC)
Die Adsorption des denaturierten Enzyms auf einem Medium kann nicht-spezifische Wechselwirkungen zwischen Enzymmolekülen effektiv hemmen, um die Refolding-Rate des Enzyms zu verbessern. Diese Methode ist hocheffizient, zeitsparend und recycelbar.

b. Gel-Filtrationschromatographie
Der molekulare Siebeffekt kann die Enzyme und kleinen Moleküle des Denaturanten trennen, was den Austausch der Lösung und das Refolding des Enzyms ermöglicht. Diese Methode erreicht ein automatisiertes Enzym-Refolding und eine Reinigung in einem Schritt.

c. Chromatographisches Refolding, vermittelt durch immobilisierte Chaperone / Faltase
Immobilisierte Chaperone oder Faltasen auf einem Medium machen die chromatographische Säule zu einem Faltungsreaktor.

• Micellen und Liposomen als unterstützende Systeme für das Enzym-Refolding

Detergenzien und Phospholipide, in Form von Micellen und Liposomen, haben das Potenzial gezeigt, das Protein-Refolding zu unterstützen. Enzymmoleküle können in einer umgekehrten Micelle eingewickelt werden, wodurch die Aggregation im Prozess des Enzymfaltens reduziert wird, und durch schrittweise Verringerung der Denaturantkonzentration und Verbindung mit REDOX falten sich denaturierte Enzyme.

• Aqueous Two-Phase Systems (ATPS)

Aqueous Two-Phase Systems (ATPS) wurden früher erfolgreich zur Rückgewinnung aktiver Enzyme eingesetzt. ATPS ermöglicht die Auflösung von Einschlusskörperchen und das Enzym-Refolding in einem Schritt.

• Refolding durch hohen hydrostatischen Druck

Hoher Druck kann Aggregate solubilisieren und gleichzeitig die native Enzymkonformation begünstigen. Diese Methode hat viele Vorteile: Solubilisierung und Enzym-Refolding werden gleichzeitig durchgeführt; unabhängig von der Enzymkonzentration; schnelles Disaggregieren und Refolding von Enzymen.

Die Rückgewinnung biologisch aktiver Enzyme ist das wichtige Ziel in der Enzymforschung, nicht nur zur Analyse der Enzymstruktur und -funktion, sondern auch zur Entwicklung therapeutischer Medikamente und industrieller Prozesse. Es gibt jedoch kein universelles Refolding-Rezept für jedes Enzym, da das Falten von Enzymen von verschiedenen physikochemischen Parametern wie Ionenstärke, pH, Temperatur, Oxidationszustand und Enzymkonzentration sowie der Anwesenheit von hydrophoben, polaren, chaotropen Agenzien und anderen Proteinen beeinflusst werden kann. Für jedes gegebene Enzym müssen die perfekten Refolding-Bedingungen individuell bestimmt werden. Creative Enzymes hat umfangreiche Erfahrungen, um Herausforderungen beim Enzym-Refolding zu lösen. Durch unsere hochmodernen Einrichtungen und unsere branchenführende technische Expertise bieten wir innovative und maßgeschneiderte Dienstleistungen zur Enzymrückgewinnung und -refolding für unsere Kunden an.