Experimentelle Aktivitätsvalidierung von Inhibitoren

Anfrage

Die experimentelle Validierung von Enzyminhibitoren ist ein entscheidender Schritt, um computergestützte Vorhersagen mit biologisch relevanten Ergebnissen zu verknüpfen. Während das virtuelle Screening und die in silico-Rangfolge eine erste Bewertung potenzieller Inhibitorverbindungen ermöglichen, erfordern deren tatsächliche Wirksamkeit, Spezifität und mechanistische Eigenschaften eine gründliche Bestätigung im Labor. Bei Creative Enzymes nutzt unser Service zur experimentellen Aktivitätsvalidierung von Inhibitoren modernste enzymologische Techniken, um quantitative und qualitative Bewertungen von Kandidatenmolekülen bereitzustellen. Dieser Prozess stellt sicher, dass Verbindungen nicht nur das Zielenzym effektiv hemmen, sondern auch günstige Eigenschaften für die Weiterentwicklung besitzen, sei es für therapeutische oder industrielle Anwendungen.

Wie die experimentelle Aktivitätsvalidierung die Wirksamkeit von Inhibitoren bestätigt

Die Entwicklung von Enzyminhibitoren beginnt mit computergestützten oder Hochdurchsatz-Screenings, um Moleküle mit potenzieller Bindungsaffinität zu einem Zielenzym zu identifizieren. Theoretische Vorhersagen allein können jedoch weder die inhibitorische Aktivität noch den praktischen Nutzen bestätigen. Die experimentelle Validierung ist unerlässlich, um:

Die inhibitorische Potenz unter physiologisch relevanten Bedingungen zu überprüfen.
Die Spezifität für das gewünschte Ziel zu bewerten und Off-Target-Interaktionen zu minimieren.
Kinetische Parameter wie IC₅₀, K_i und den Hemmungsmodus zu charakterisieren.
Mechanistische Einblicke für die Optimierung der Struktur-Wirkungs-Beziehung (SAR) zu liefern.

Experimental Activity Validation of Inhibitors

Durch die systematische Validierung von Enzyminhibitoren in vitro können Forschende Kandidaten mit Zuversicht in präklinische Studien oder industrielle Anwendungen überführen und gleichzeitig kostspielige Fehlschläge minimieren.

Unsere robusten Serviceangebote

Creative Enzymes bietet einen umfassenden Service zur experimentellen Aktivitätsvalidierung, der darauf ausgelegt ist, in silico-Vorhersagen in experimentell bestätigte Inhibitoren zu überführen. Unsere Plattform integriert robuste Enzymassays mit detaillierten kinetischen und mechanistischen Analysen, sodass Kunden:

Die inhibitorische Potenz und Bindungsaffinität quantitativ messen können.
Die Enzymspezifität und potenzielle Off-Target-Effekte bewerten können.
Die Stabilität und Reproduzierbarkeit von Verbindungen unter verschiedenen experimentellen Bedingungen evaluieren können.
Verwertbare Daten generieren, die die nachgelagerte Optimierung und Entwicklung steuern.

Durch unseren rigorosen Ansatz bieten wir eine entscheidende Brücke zwischen computergestützter Entdeckung und praktischer Anwendung und gewährleisten ein hohes Maß an Vertrauen bei der Auswahl von Leitverbindungen.

Parameter, die wir messen

Unser Service bewertet ein breites Spektrum an Parametern, um eine umfassende Charakterisierung jeder Kandidatenverbindung sicherzustellen:

Parameter	Beschreibung
Inhibitorische Potenz	Quantitative Messung von IC₅₀, K_i und anderen Dosis-Wirkungs-Metriken zur Bestimmung der Hemmstärke.
Mechanistische Einblicke	Bestimmung des Hemmungsmodus, einschließlich kompetitiver, nicht-kompetitiver, unkompetitiver und gemischter Hemmung.
Spezifität und Selektivität	Bewertung von Off-Target-Interaktionen mithilfe von Panels homologer oder verwandter Enzyme.
Kinetische Parameter	Enzymkinetische Konstanten (K_M, V_max) in Anwesenheit und Abwesenheit von Inhibitoren zur Beurteilung des Einflusses auf die Katalyse.
Thermische und pH-Stabilität	Bewertung der Inhibitoraktivität bei unterschiedlichen Temperaturen und pH-Bereichen zur Beurteilung der Robustheit.
Reproduzierbarkeit und Chargenkonsistenz	Überprüfung der konsistenten Aktivität über mehrere experimentelle Replikate oder Verbindungschargen hinweg.
Allosterische Effekte und Modulation	Erkennung nicht-klassischer Hemmungseffekte, die die Enzymregulation beeinflussen können.

Experimentelle Methoden, die wir anwenden

Um genaue und reproduzierbare Daten zu erhalten, setzen wir eine Reihe von in vitro-Methoden ein, die auf das Zielenzym und die Inhibitorklasse zugeschnitten sind:

Methoden	Beschreibung
Spektrophotometrische und Fluoreszenz-Assays	Zur Echtzeitüberwachung der Enzymaktivität mit chromogenen oder fluorogenen Substraten.
HPLC- und LC–MS-Analysen	Zur präzisen Quantifizierung der Substratumsetzung und Inhibitoreffekte.
Surface Plasmon Resonance (SPR) und Biolayer Interferometry (BLI)	Zur Messung direkter Bindungskinetiken, einschließlich Assoziations-/Dissoziationsraten und Bindungsaffinitäten.
Isotherme Titrationskalorimetrie (ITC)	Zur Bestimmung von Bindungsthermodynamik, Stöchiometrie und energetischen Parametern.
High-Throughput Screening (HTS)-Plattformen	Zur schnellen Bewertung großer Verbindungssätze gegen Zielenzyme.
Mechanistische kinetische Analyse	Detaillierte Bewertung der Inhibitoreffekte auf Enzymkatalysezyklen, einschließlich kompetitiver, nicht-kompetitiver und allosterischer Mechanismen.

Service-Workflow

Workflow of experimental activity validation for enzyme inhibitors

Kontaktieren Sie unser Team

Warum Creative Enzymes wählen

Umfassende quantitative Analyse

Die Messung von IC₅₀, K_i und kinetischen Parametern gewährleistet eine präzise Bewertung der Hemmpotenz.

Hohe Spezifitätsbewertung

Multiparametrische Assays minimieren Off-Target-Effekte und erhöhen das Vertrauen in die Zielbindung.

Mechanistische Einblicke

Detaillierte Studien zum Hemmungsmodus unterstützen die rationale, SAR-gesteuerte Optimierung.

Anpassbare Assays

Flexibles Assay-Design ermöglicht die Anpassung an verschiedene Enzymklassen und experimentelle Bedingungen.

Hohe Reproduzierbarkeit

Strenge Qualitätskontrollen und standardisierte Protokolle garantieren konsistente und zuverlässige Ergebnisse.

Verwertbare Daten

Klare, detaillierte Berichte unterstützen fundierte Entscheidungen für die präklinische Entwicklung oder industrielle Anwendung.

Fallstudien und Anwendungen aus der Praxis

Fall 1: Experimentelle Validierung bestätigt in silico-Vorhersagen von Mebendazol als potenten MAPK14-Inhibitor

Polypharmakologie ermöglicht es Arzneimitteln, auf mehrere molekulare Ziele zu wirken, und bietet Chancen für die Umwidmung zugelassener Medikamente. Mithilfe der in silico-Zielvorhersage wurde der Wirkmechanismus des Anthelminthikums Mebendazol für die Behandlung von Glioblastomen untersucht. Mebendazol verringerte die Lebensfähigkeit von Glioblastomzellen (IC₅₀ 288 nM–2,1 µM) und wurde als interagierend mit 21 Zielen vorhergesagt, darunter 12, die in Tumoren hochreguliert sind. Die experimentelle Validierung bestätigte die dosisabhängige Hemmung der Schlüsselenzyme ABL1, MAPK1/ERK2 und insbesondere MAPK14/p38α (IC₅₀ = 104 ± 46 nM). Molekulares Modellieren und Gen-Silencing-Studien bestätigten MAPK14 als entscheidenden Vermittler des Tumorsphäroidwachstums und der Arzneimittelantwort, was MAPK14 als therapeutisches Ziel hervorhebt und die Entwicklung neuer Inhibitoren unterstützt.

In silico target prediction identifies mebendazole as a potent MAPK14 inhibitor Abbildung 1. In vitro-Validierung der Proteinkinasehemmung durch Benzimidazol-Verbindungen. Die konzentrationsabhängige Hemmung von ABL1 (A), MAPK14 (B) und ERK2 (C) durch Benzimidazol-Verbindungen wurde mittels Kinase-Assay wie beschrieben bestimmt. Dasatinib, SB203580 und SCH772984 wurden als positive Kontrolle zur Hemmung der Kinaseaktivität von ABL1, MAPK14 bzw. ERK2 verwendet. (Ariey‐Bonnet et al., 2020)

Fall 2: Vorhersage und Validierung einer MMP-1-Aktivitätsklippe

Mit der SAR Matrix (SARM)-Methode wurde eine starke Aktivitätsklippe zwischen Verbindung 3 und einem virtuellen Analogon, Verbindung 4, für die MMP-1-Hemmung vorhergesagt. Verbindung 4, die eine para-Trifluormethylgruppe enthält, wurde aufgrund von Interaktionen mit ARG214 als über 60-fach aktiver als Verbindung 3 vorhergesagt. Nach der Synthese bestätigten in vitro-Assays diese Vorhersage (IC₅₀ 0,18 µM vs. 11,5 µM). Diastereomere und Kontrollverbindungen unterstrichen die entscheidende Rolle des Trifluormethyl-Substituenten und der Stereochemie. Diese Studie zeigt die Fähigkeit von SARM, seltene Aktivitätsklippen systematisch zu identifizieren und das Design hochpotenter Enzyminhibitoren ohne vorherige SAR-Kenntnisse zu steuern.

Tabelle 1 MMP-1-inhibitorische Aktivität der synthetisierten Verbindungen. (Asawa et al., 2020)

SAR matrix-based prediction and experimental validation of an MMP-1 inhibitor activity cliff

^aDie für 50% Hemmung erforderliche Verbindungskonzentration (IC₅₀) wurde aus semi-logarithmischen Dosis-Wirkungs-Kurven bestimmt, und die Ergebnisse stellen den Mittelwert ± Standardabweichung von dreifach bestimmten Proben dar.

FAQs zu experimentellen Inhibitor-Aktivitätsvalidierungsdiensten

F: Welche Enzymtypen können getestet werden?

A: Wir decken ein breites Spektrum an Enzymklassen ab, darunter Kinasen, Proteasen, Hydrolasen, Oxidoreduktasen, Transferasen und weitere spezialisierte Ziele. Unsere Plattform ist sowohl für rekombinante als auch native Enzyme anpassbar, sodass wir physiologische oder industrielle Bedingungen so genau wie möglich nachbilden können. Diese Flexibilität stellt sicher, dass praktisch jedes gewünschte Enzym einer präzisen Aktivitätsvalidierung unterzogen werden kann, um sowohl Forschung als auch angewandte Entwicklung zu unterstützen.
F: Können individuelle Assay-Formate entwickelt werden?

A: Ja. Wir bieten vollständig maßgeschneiderte Assay-Designs, um spezifische Kundenanforderungen zu erfüllen, einschließlich einzigartiger Substrate, Kofaktoren, pH-Bedingungen oder Temperaturbereiche. Unser Team arbeitet eng mit den Kunden zusammen, um Assays zu entwickeln, die biologisch relevante Szenarien widerspiegeln, sodass die resultierenden Daten die in vivo- oder prozessrelevante Inhibitorleistung genau vorhersagen. Die Anpassung erstreckt sich sowohl auf Hochdurchsatz-Screening-Formate als auch auf detaillierte kinetische Studien.
F: Welche Parameter werden während der Validierung gemessen?

A: Wir messen eine umfassende Reihe von Parametern, um eine vollständige Charakterisierung der inhibitorischen Aktivität sicherzustellen. Dazu gehören IC₅₀, K_i, Hemmungsmodus (kompetitiv, nicht-kompetitiv, unkompetitiv oder gemischt), Spezifität gegenüber Off-Target-Enzymen und potenzielle allosterische Effekte. Zusätzlich bewerten wir die Stabilität der Verbindung unter Assay-Bedingungen und die Reproduzierbarkeit über mehrere experimentelle Replikate, um zuverlässige, verwertbare Ergebnisse zu gewährleisten.
F: Wie lange dauert der Validierungsprozess?

A: Die typischen Zeitrahmen liegen bei 4–8 Wochen für Standard-Enzymassays, wobei komplexere Projekte mit Multi-Target- oder mechanistischem Profiling zusätzliche Zeit erfordern können. Wir bieten eine detaillierte Projektplanung und regelmäßige Fortschrittsberichte, um Transparenz während des gesamten Prozesses zu gewährleisten. Für dringende Projekte können auch beschleunigte Zeitpläne ohne Kompromisse bei Datenqualität oder Reproduzierbarkeit vereinbart werden.
F: Bieten Sie Unterstützung bei der Verbindungsoptimierung?

A: Ja. Über die Bereitstellung quantitativer Daten hinaus enthalten unsere Berichte detaillierte mechanistische Analysen, SAR-Einblicke und verwertbare Empfehlungen zur weiteren Entwicklung. Wir heben wichtige Struktur-Wirkungs-Trends, potenzielle Off-Target-Risiken und Strategien zur Verbesserung der Potenz oder Selektivität hervor. Diese integrierte Beratung unterstützt die rationale Optimierung und beschleunigt den Übergang von der Leitstrukturerkennung zur präklinischen oder industriellen Umsetzung.
F: Wie stellen Sie Spezifität sicher und minimieren Off-Target-Effekte?

A: Spezifität ist ein Kernelement unseres Validierungsprozesses. Wir setzen multiparametrische Assays und vergleichende Tests mit homologen oder verwandten Enzymen ein, um Off-Target-Aktivitäten zu erkennen. Jede Kreuzreaktivität wird dokumentiert und quantifiziert, sodass Kunden ein klares Verständnis des Selektivitätsprofils des Inhibitors erhalten. Diese Informationen sind entscheidend, um Verbindungen mit hohem therapeutischem Potenzial und minimalen Nebenwirkungen zu priorisieren.
F: Können Sie Inhibitoren für industrielle Anwendungen unterstützen?

A: Absolut. Wir entwickeln Assays, die industrielle Prozessbedingungen widerspiegeln, einschließlich extremer pH-Werte, Temperaturen oder Substratkonzentrationen. Unser Team bewertet sowohl die Potenz als auch die betriebliche Stabilität, um sicherzustellen, dass Inhibitoren unter realen Produktions- oder prozessrelevanten Bedingungen zuverlässig funktionieren. Diese Fähigkeit hilft Kunden, Kandidaten zu identifizieren, die sowohl wirksam als auch robust für den großtechnischen Einsatz sind.
F: Wie wird die Datenqualität und Reproduzierbarkeit sichergestellt?

A: Jeder Assay wird unter strengen Qualitätskontrollprotokollen mit standardisierten Reagenzien, Kontrollen und Replikaten durchgeführt. Die Daten werden mit validierter Software analysiert und gründlich auf Konsistenz überprüft. Unser rigoroser Ansatz garantiert Reproduzierbarkeit und Vertrauen in die Ergebnisse, sodass Kunden fundierte Entscheidungen für die nachgelagerte Optimierung oder Entwicklung treffen können.

Referenzen:

Ariey‐Bonnet J, Carrasco K, Le Grand M, et al. In silico molecular target prediction unveils mebendazole as a potent MAPK14 inhibitor. Molecular Oncology. 2020;14(12):3083-3099. doi:10.1002/1878-0261.12810
Asawa Y, Yoshimori A, Bajorath J, Nakamura H. Prediction of an MMP-1 inhibitor activity cliff using the SAR matrix approach and its experimental validation. Sci Rep. 2020;10(1):14710. doi:10.1038/s41598-020-71696-2

Vorname:

Nachname:

E-Mail *

Telefonnummer:

Unternehmen/Institution:

Land oder Region:

Menge:

Dienstleistungen & Produkte von Interessierten

Projektbeschreibung:

Nur für Forschung und industrielle Verwendung, nicht für den persönlichen medizinischen Gebrauch.

Dienstleistungen

Online-Anfrage