Expression und Reinigung von Varianten der zufälligen Mutagenese

Anfrage

Nachfolgend erfolgreich Mutagenese und ScreeningDie nächste kritische Phase in der Enzymtechnik ist die Expression und Reinigung vielversprechender mutierter Enzyme. Nur durch die Produktion von hochwertigem Protein kann eine funktionale und strukturelle Charakterisierung durchgeführt werden, die sicherstellt, dass die in vorläufigen Tests identifizierten verbesserten Varianten ihre Eigenschaften unter kontrollierten, reproduzierbaren Bedingungen beibehalten.

Bei Kreative Enzyme, wir sind spezialisiert auf die Expression und Reinigung von Varianten der zufälligen Mutagenese, maßgeschneiderte Lösungen anzubieten, die genetische Konstrukte in hochreine, funktionell aktive Enzyme umwandeln. Unsere multidisziplinäre Plattform kombiniert optimierte Wirtsysteme, skalierbare Expressionsstrategien und hochauflösende Reinigungsabläufe, um mutierte Proteine von außergewöhnlicher Qualität bereitzustellen.

Durch die Integration von Ausdrucksoptimierung, Reinigungsverbesserung und Qualitätsvalidierung stellen wir sicher, dass jede Variante – egal wie neuartig – zuverlässig produziert und bewertet werden kann. Dieser Service ist eine wichtige Brücke zwischen genetischer Innovation und biochemischem Verständnis und unterstützt sowohl das mechanistische Verständnis als auch die industrielle Anwendung von entwickelten Enzymen.

Expression und Reinigung: Grundlage der nachgelagerten Enzymanalyse

Der Prozess von zufällige Mutagenese und DNA-Shuffling generiert enorme genetische Vielfalt und führt oft zu Mutanten mit potenziell verbesserten Eigenschaften wie katalytischer Effizienz, Thermostabilität oder veränderter Substratspezifität. Das wahre Potenzial dieser Varianten kann jedoch erst realisiert werden, wenn sie als funktionale Proteine exprimiert und gereinigt werden.

Die Expression und Reinigung bilden die Grundlage der nachgelagerten Enzymanalyse. Ohne angemessene Ausbeuten, korrektes Falten oder Reinheit werden nachfolgende biochemische und kinetische Studien unzuverlässig. Zufällige Mutationen können nicht nur katalytische Reste, sondern auch das Falten, die Löslichkeit und die Stabilität beeinflussen, die direkt die Ausdrucksleistung beeinflussen.

Darüber hinaus erfordern industrielle und Forschungsanwendungen skalierbare und reproduzierbare Enzymproduktionssysteme. Das Erreichen konsistenter Expressionsniveaus, korrekter posttranslationaler Modifikationen und hoher Rückgewinnungsraten ist entscheidend für die Bewertung der Leistung von Varianten unter physiologisch oder industriell relevanten Bedingungen.

Expression and purification services of random mutagenesis variants at Creative Enzymes

Um diesen Herausforderungen zu begegnen, nutzt Creative Enzymes jahrzehntelange Erfahrung in der Proteinexpression, -reinigung und -charakterisierung. Wir bieten angepasste Workflows die die einzigartigen Herausforderungen bei der Expression von zufällig mutierten Enzymen berücksichtigen – das Gleichgewicht zwischen Ertrag, Löslichkeit und Aktivität wahren und gleichzeitig die Treue zur mutierten Sequenz aufrechterhalten.

Was wir anbieten

Creative Enzymes bietet ein umfassendes Portfolio an Expressions- und Reinigungsdiensten, die speziell für mutierte Enzyme entwickelt wurden, die durch zufällige Mutagenese oder DNA-Shuffling erzeugt wurden. Unser Angebot umfasst die gesamte Pipeline vom Gen bis zum gereinigten Protein:

Konstruktionsvorbereitung und Vektoroptimierung

Subklonierung von mutierten Genen in optimierte Expressionsvektoren.
Codon-Optimierung und Promotorauswahl für verbesserte Translations-Effizienz.
Integration von Affinitäts-Tags (His-Tag, GST, MBP usw.) für die nachgelagerte Reinigung.

Verschiedene Expressionssysteme

Prokaryotisch: E. coli für schnelle, ertragreiche Expression.
Hefe: Pichia pastoris und Saccharomyces cerevisiae für sekretierte und posttranslational modifizierte Proteine.
Insekten- und Säugetiersysteme: Für komplexe Enzyme, die Faltungschaperone oder Glykosylierung benötigen.

Expressionsscreening und -optimierung

Kleinmaßstäbliche Ausdruckstests unter verschiedenen Bedingungen (Temperatur, Induktor-Konzentration, Vektorvarianten).
Löslichkeit und Analyse von Einschlusskörperchen.
Optionale Co-Expression mit molekularen Chaperonen oder Faltungskatalysatoren.

Reinigung und Politur

Affinitäts-, Ionenaustausch- und Größenausschlusschromatographie, die auf die Eigenschaften von Enzymen abgestimmt ist.
Hochdurchsatz-Reinigungsprotokolle für Mutanten-Panels.
Refoldungsstrategien für unlösliche oder aggregierte Proteine.

Qualitäts- und Funktionsvalidierung

SDS-PAGE, Western-Blot und HPLC-Überprüfung der Reinheit und Molekulargewichts.
Enzymatische Aktivitätsassays zur Bestätigung der nativen Faltung und katalytischen Integrität.
Protein-Konzentration und Stabilitätsanalyse.

Skalierungsoptionen

Produktion von analytischem zu präparativem Maßstab.
Fermentationsbasierte Expression für industrielle Mengen.

Umfassende Berichterstattung und Lieferung

Detaillierte Expressionsdaten, Chromatogramme und Reinheitsprofile.
Lieferung des gereinigten Enzyms, des Expressionsplasmids und des Expressionswirts (falls erforderlich).

Service-Workflow

Service workflow of expression and purification of random mutagenesis variants

Dienstleistungen Funktionen

Parameter	Spezifikation
Ausdruckssysteme	E. coli, Pichia pastoris, Bacillus subtilisInsekten-, oder Säugetierzellen
Reinigungstechniken	Affinitäts-, Ionenaustausch-, hydrophobe Wechselwirkung und Größenausschlusschromatographie
Ausdrucksskala	1 mL (Pilot) auf 20 L (Skalierung)
Reinheitsgrad	>90 % durch SDS-PAGE; optional >95 % für analytische Enzymqualität
Aktivitätsüberprüfung	Auf Assays, die auf den Enzymtyp zugeschnitten sind (Oxidoreduktasen, Hydrolasen, Transferasen usw.)
Tag-Entfernung	Protease-Spaltung (z.B. TEV, Thrombin) optional
Liefergegenstände	Reinigtes Enzym, Expressionsvektor, Wirtsstamm, Reinigungsbericht
Durchlaufzeit	3–6 Wochen, abhängig von der Enzymkomplexität und dem Maßstab.

Ein Angebot einholen

Warum uns wählen

Spezialisierung auf mutante Enzyme

Wir konzentrieren uns auf Enzyme, die durch Mutagenese und DNA-Shuffling erzeugt werden, und gehen Herausforderungen in Bezug auf Löslichkeit, Faltung und Stabilität an.

Integrierter Workflow

Expression und Reinigung sind vollständig mit Mutagenese, Screening und Assaysentwicklung für eine echte durchgehende Unterstützung verbunden.

Umfassende Systemoptionen

Wir bieten mehrere Wirte und Reinigungsplattformen an, die auf die Bedürfnisse Ihres Enzyms abgestimmt sind – von einfachen bakteriellen Systemen bis hin zu komplexen eukaryotischen Setups.

Datengetriebene Optimierung

Die Bedingungen werden mithilfe von Echtzeitdaten verfeinert, um den Ertrag und die Aktivität zu maximieren und gleichzeitig Zeit und Ressourcen zu reduzieren.

Hohe Reproduzierbarkeit und Rückverfolgbarkeit

Jeder Schritt wird dokumentiert und validiert, um eine konsistente, nachvollziehbare Produktion für Forschungs- oder Vorindustrielle Arbeiten zu gewährleisten.

Expertenunterstützung und Vertraulichkeit

Unsere Spezialisten bieten kontinuierliche Beratung, und alle Kundenmaterialien sind durch strikte Vertraulichkeit geschützt.

Fallstudien und Erfolgsgeschichten

Fall 1: Expression und Reinigung einer zufällig mutierten Esterase-Bibliothek

Kundenbedarf:

Ein Biotechnologieunternehmen entwickelte ein 10⁵-esterase-Mutantenbibliothek und identifizierte mehrere vielversprechende Kandidaten mit verbesserter hydrolytischer Aktivität. Die Varianten wiesen jedoch eine inkonsistente Expression und Löslichkeit auf, was eine weitere Charakterisierung erschwerte.

Unser Ansatz:

Wir subklonierten die ausgewählten Gene in ein T7-basiertes E. coli Expressionssystem mit N-terminalen His-Tags. Wir haben die Expressionsparameter – einschließlich Induktionstemperatur und IPTG-Konzentration – in kleinen Kulturen optimiert. Lösliche Fraktionen wurden mittels Nickel-Affinitäts- und Gel-Filtrationschromatographie gereinigt.

Ergebnis:

Die hochgradig lösliche Expression wurde für alle fünf Varianten erreicht, wobei jede eine Reinheit von über 95 % erreichte. Funktionale Assays bestätigten eine verbesserte Aktivität im Vergleich zum Wildtyp, was validierte, dass die während des Screenings beobachteten verbesserten Phänotypen intrinsisch mit der Proteinsequenz und nicht mit Artefakten der Expression verbunden waren.

Fall 2: Reinigung eines thermostabilen Mutantenprotease für industrielle Anwendungen

Kundenbedarf:

Ein Hersteller industrieller Enzyme benötigte Milligramm-Mengen eines für Thermostabilität entwickelten Protease-Mutanten. Das Enzym zeigte eine starke Aktivität, war jedoch während der Reinigung anfällig für Aggregation.

Unser Ansatz:

Wir haben das Enzym exprimiert in Bacillus subtilis, was die Sekretion in das Medium ermöglicht und die Reinigung vereinfacht. Der Prozess kombinierte Ammoniumsulfat-Fällung, Ionenaustauschchromatographie und Gel-Filtration unter temperaturkontrollierten Bedingungen.

Ergebnis:

Über 100 mg hochreiner Enzyme wurden pro Liter Kultur produziert. Die finale Protease behielt nach einer Inkubation bei 75 °C für eine Stunde 95 % ihrer Aktivität. Der Prozess wurde erfolgreich für die Pilotfermentation hochskaliert, um nachgelagerte Formulierungstests zu unterstützen.

Häufig gestellte Fragen

Q: Welche Arten von Enzymen können Sie exprimieren und reinigen?

A: Wir können eine breite Palette von Enzymen verarbeiten, einschließlich Oxidoreduktasen, Hydrolasen, Transferasen, Lyasen, Isomerasen und Ligasen. Sowohl lösliche als auch membranständige Enzyme können berücksichtigt werden.
F: Können Sie mit unlöslichen oder zur Aggregation neigenden Mutanten arbeiten?

A: Ja. Wir bieten Protokolle zur Solubilisierung und Refaltung von Einschlusskörperchen sowie alternative Expressionssysteme für verbesserte Löslichkeit an.
F: Welche Wirtsysteme empfehlen Sie für mutierte Enzyme?

A: E. coli ist ideal für eine schnelle, wirtschaftliche Expression. Für komplexe oder glykosylierte Proteine empfehlen wir Pichia pastoris, Insekten-, oder Säugetierzellen.
F: Wie stellen Sie die Aktivität von gereinigten Enzymen sicher?

A: Wir führen enzym-spezifische Aktivitätsassays und strukturelle Überprüfungen durch, um korrektes Falten und Funktion zu bestätigen.
Welche Produktionsskala steht zur Verfügung?

A: Wir unterstützen die Produktion von kleinmaßstäblichen analytischen Tests (Milligramm-Mengen) bis hin zu präparativen und pilotmaßstäblichen Fermentationen (Gramm-Mengen).
F: Können Sie Affinitäts-Tags entfernen?

A: Ja. Tags können enzymatisch abgespalten werden (z. B. durch TEV- oder Thrombin-Protease) und durch sekundäre Reinigungsschritte entfernt werden.
Bieten Sie Berichte mit experimentellen Details an?

A: Jedes Projekt umfasst einen detaillierten Bericht, der die Expressionskonstrukte, chromatographischen Schritte, Ausbeute, Reinheit und Prüfergebnisse beschreibt.
Q: Wie lange dauert in der Regel die Bearbeitung?

A: Je nach Komplexität des Enzyms, des Expressionssystems und des Maßstabs dauern Projekte typischerweise 3–6 Wochen.
F: Kann dieser Service mit Mutagenese oder Screening integriert werden?

A: Absolut. Es ist Teil unseres downstream Workflows und integriert sich direkt mit unseren zufälligen Mutagenese-, Assay-Entwicklungs- und Screening-Dienstleistungen.
Q: Wie wird mit geistigem Eigentum umgegangen?

A: Alle Enzymsequenzen, Daten und Ergebnisse bleiben alleiniges Eigentum des Kunden. Wir wahren strikte Vertraulichkeit und bewahren oder verwenden keine Materialien des Kunden ohne dessen Zustimmung.

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Dienstleistungen & Produkte von Interessierten

Projektbeschreibung:

Nur für Forschungs- und Industriezwecke. Nicht für den persönlichen Gebrauch bestimmt. Bestimmte Produkte in Lebensmittelqualität eignen sich für die Formulierungsentwicklung in Lebensmitteln und verwandten Anwendungen.

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