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Expression und Reinigung von Varianten der gerichteten Mutagenese

Anfrage

Kreative Enzyme bietet Expression und Reinigung von Varianten der gerichteten Mutagenese als ein Kernbestandteil von unserem Downstream-Dienstleistungen für standortgerichtete Mutagenese (SDM)Dieser Service überbrückt die Lücke zwischen genetischer Modifikation und funktioneller Charakterisierung und stellt sicher, dass jede konstruierte Enzymvariante korrekt exprimiert und auf Homogenität gereinigt wird, um anschließende biochemische und strukturelle Analysen zu ermöglichen. Durch die Nutzung eines umfangreichen Spektrums heterologer Expressionssysteme und Reinigungstechnologien liefern wir reproduzierbare, skalierbare und qualitativ hochwertige Proteinpräparationen. Egal, ob Ihr Fokus auf Aktivitätsbewertung, mechanistischer Aufklärung oder industriellem Testen liegt, Creative Enzymes gewährleistet präzise Ausführung, optimalen Ertrag und strukturelle Integrität für jedes mutierte Enzym.

Einführung in die Expression und Reinigung von konstruierten Enzymen durch SDM

Die erfolgreiche Konstruktion von Enzymen durch gerichtete Mutagenese hängt nicht nur von der Einführung genauer genetischer Veränderungen ab, sondern auch von der Gewinnung korrekt gefalteter, funktioneller Proteine für die nachgelagerte Charakterisierung. Die Expression von mutierten Enzymen kann jedoch aufgrund von Veränderungen in der Löslichkeit, Faltkinetik oder Stabilität herausfordernd sein. Selbst subtile Aminosäureaustausche können die Expressionsniveaus oder Reinigungsprofile stören, was zu fehlgefalteten oder inaktiven Produkten führt.

Creative Enzymes begegnet diesen Herausforderungen durch maßgeschneiderte Ausdrucksoptimierung und mehrstufige Reinigungsabläufe entwickelt, um die strukturelle und funktionale Integrität von mutierten Enzymen aufrechtzuerhalten. Unsere Wissenschaftler kombinieren tiefgehende Expertise in der Proteinexpressionsbiologie mit fortschrittlichen Reinigungsplattformen, um eine breite Palette von Expressionswirten zu berücksichtigen – einschließlich bakterieller, Hefe-, Insekten- und Säugetiersysteme.

Workflow of protein expression—target identification, cloning, transformation, and cell harvest—and protein purification steps including lysis, purification, and analysisAbbildung 1. Arbeitsablauf der Proteinexpression und -reinigung. (Ertem u. a.., 2022)

Expression und Reinigung von SDM-Varianten: Dienstleistungen und Kapazitäten

Durch die Bereitstellung eines integrierten, hochwertigen Workflows von der Expression bis zum gereinigten Protein ermöglichen Creative Enzymes Forschern, nahtlos von der Mutationsgestaltung zur funktionalen Entdeckung überzugehen und sicherzustellen, dass jede Variante in nachgelagerten Assays genau repräsentiert ist. Unsere Kapazitäten umfassen:

Auswahl eines maßgeschneiderten Expressionssystems

Auswahl des optimalen Hosts (z. B., E. coli, Bacillus, Pichia pastoris, Insekten- oder Säugetierzellen) basierend auf den Eigenschaften von Proteinen und den Projektzielen.

Codon-Optimierung und Vorbereitung des Expressionsvektors

Optimierung von Gensequenzen für wirtspezifische Kodonverwendung und Subklonierung in geeignete Expressionsvektoren.

Expressionsscreening und -optimierung

Bewertung der Induktionsbedingungen, Temperatur und Expressionsniveaus zur Maximierung des löslichen Ertrags und Minimierung von Einschlusskörperchen.

Löslichkeit und Refaltung von Einschlusskörperchen

Spezialisierte Protokolle zur Rückgewinnung aktiver Proteine aus unlöslichen Fraktionen unter Verwendung von Gradientennachfaltung oder chaperonunterstützten Methoden.

Affinity- und tagbasierte Reinigung

Verwendung von Ni-NTA-, GST-, His-, FLAG- oder Strep-Tag-Reinigung, kombiniert mit Ionenaustausch- und Größenausschlusschromatographie nach Bedarf.

Endotoxinentfernung und Pufferwechsel

Hochreine Proteinpräparation für biochemische Assays, biophysikalische Charakterisierung oder zellbasierte Studien.

Reinheits- und Integritätsvalidierung

SDS-PAGE, Western Blot und LC-MS-Analysen zur Bestätigung von Proteingröße, Reinheit und Identität.

Flexible Lieferformate

Proteine werden gefriergetrocknet oder in Lösung, in vom Benutzer angegebenen Puffern und Konzentrationen, geliefert.

Service-Workflow

Schritt Einzelheiten
Projektberatung und -design Unser wissenschaftliches Team überprüft Ihre Konstruktion, Ausdrucksziele und gewünschten Ergebnisse (z. B. lösliches Enzym, Membranprotein, markierte Variante).
Wirt- und Vektorenauswahl Basierend auf der Enzymklasse, der Größe und den posttranslationalen Anforderungen wählen oder empfehlen wir das am besten geeignete Expressionssystem und die Vektorkonfiguration.
Ausdruckstest und Optimierung Kleinmaßstäbliche Pilotversuche werden durchgeführt, um die besten Induktionsbedingungen, Wirtsstämme und Temperaturen zu bestimmen, um die lösliche Expression zu maximieren.
Proteinproduktion und Ernte Die hochskalierten Ausdrucksprozesse werden unter optimierten Bedingungen durchgeführt, gefolgt von der Zelllyse mittels mechanischer oder enzymatischer Zerstörung.
Reinigung Zielproteine werden durch mehrstufige Chromatographie (Affinitäts-, Ionenaustausch- und Größenausschlusschromatographie) gereinigt, um die gewünschte Reinheit und Ausbeute zu erreichen.
Qualitätsprüfung Jede Charge unterliegt einer gründlichen analytischen Validierung, einschließlich SDS-PAGE, Reinheitsquantifizierung und funktioneller Bewertung, wo zutreffend.
Lieferung und Dokumentation Die endgültigen Proteinprodukte werden mit detaillierten QC-Daten, Reinigungsprofilen und optionalen Lagerungsempfehlungen versendet.

Verbindungsdienste

Dieser Service ist Teil des integrierten Angebots von Creative Enzymes. Downstream-Dienstleistungen für die standortspezifische Mutagenese, entworfen, um genetische Modifikationen in funktionale Erkenntnisse umzuwandeln. Um Ihr Projekt zu erweitern, ziehen Sie in Betracht:

Zusammen bieten diese drei Dienstleistungen einen vollständigen downstream Workflow, von der Expression und Reinigung über die Aktivitätsvalidierung bis hin zum mechanistischen Verständnis – und ermöglichen einen vollständigen Zyklus der Entdeckung in der Enzymtechnik.

Ein Angebot anfordern

Warum Sie uns wählen sollten

Umfassendes Systemportfolio

Umfassende Erfahrung in bakteriellen, Hefen-, Insekten- und Säugetiersystemen gewährleistet eine erfolgreiche Expression verschiedener Enzymmutanten.

Optimierte Arbeitsablauf-Effizienz

Integrierte Ausdrucks- und Reinigungsplattformen reduzieren die Übergangszeit zwischen den Schritten und beschleunigen den Abschluss von Projekten.

Expertenhandhabung von schwierigen Proteinen

Nachgewiesene Expertise in der Refaltung von unlöslichen Mutanten und der Stabilisierung von aggregationsanfälligen Varianten.

Strenge Qualitätskontrolle

Jedes Konstrukt durchläuft eine mehrschichtige Validierung, um Reinheit, Identität und Aktivität sicherzustellen.

Skalierbarkeit und Flexibilität

Die Fähigkeiten reichen von kleinen analytischen Chargen für das Screening bis hin zur Großproduktion für industrielle Anwendungen.

Nahtlose Integration mit nachgelagerter Analyse

Reinige Proteine werden in assay-bereiter Form geliefert, um sofort in Aktivitätsassays oder strukturellen Studien verwendet zu werden.

Vertretende Fallstudien

Fall 1: Optimierte Expression eines Mutantenenzym mit geringer Löslichkeit

Kundenbedarf:

Ein Forschungsinstitut, das an thermostabilen Xylanasen arbeitet, benötigte die lösliche Expression eines gezielt mutierten Proteins, das entwickelt wurde, um die Substratspezifität zu verbessern. Allerdings bildete das rekombinante Protein bei der Expression konstant unlösliche Einschlusskörper. E. coli, was funktionale Tests und Kristallisationsversuche verhindert.

Unser Ansatz:

Wir haben eine systematische Bewertung von mehreren durchgeführt. E. coli Expressionsstämme (BL21(DE3), Rosetta und ArcticExpress) und optimierte Induktionsbedingungen durch Anpassung der IPTG-Konzentration, Temperatur und Nachinduktionsdauer. Als die Löslichkeit weiterhin suboptimal blieb, implementierten wir ein schrittweises Refaltungsprotokoll unter Verwendung der Urea-Gradientenentfernung in redoxkontrollierten Puffern, um die korrekte Disulfidbildung zu fördern. Analytische SEC und SDS-PAGE bestätigten die ordnungsgemäße Refaltung und Monodispersität.

Ergebnis:

Die lösliche Ausbeute erhöhte sich um das Achtfache, und die refoldierte Xylanase behielt 95 % der katalytischen Aktivität des Wildtyps bei. Das gereinigte Mutantenprotein wurde erfolgreich für die Röntgenkristallographie und kinetische Profilierung verwendet, was strukturelle Einblicke in die Substratbindung und Mechanismen der thermischen Anpassung lieferte.

Fall 2: Skalierbare Reinigung eines mutierten Oxidoreduktase für mechanistische Studien

Kundenbedarf:

Ein Unternehmen der industriellen Biotechnologie hatte das Ziel, 50 mg einer triple-mutierten Oxidoreduktase für kinetische Assays und Kristallographie zu produzieren. Zuvor E. coli Die Expression ergab niedrige Titer und heterogene Glykosylierung, was die Proteinqualität und Reproduzierbarkeit über die Chargen hinweg beeinträchtigte.

Unser Ansatz:

Wir haben das Projekt zu einem gewechselt. Pichia pastoris Expressionssystem, das für die Produktion sekretorischer Proteine optimiert ist. Die Expressionsparameter – einschließlich Methanolinduktionsrate, Kulturdichte und pH-Wert – wurden feinabgestimmt, um den Ertrag zu maximieren. Die nachgelagerte Reinigung verwendete einen zweistufigen Prozess, der Ni-NTA-Affinitäts- und Größenausschlusschromatographie kombinierte, um sowohl Reinheit als auch strukturelle Homogenität sicherzustellen. Jede Reinigungscharge wurde durch SDS-PAGE und LC-MS validiert, um die Sequenzintegrität zu bestätigen.

Ergebnis:

Der Prozess erzeugte konstant über 50 mg Enzym pro Charge mit >97% Reinheit und hervorragender Reproduzierbarkeit von Charge zu Charge. Der Triple-Mutant wies eine um 7 °C höhere Schmelztemperatur als der Wildtyp auf, was die verbesserte strukturelle Stabilität bestätigte und präzise kinetische und kristallographische Analysen ermöglichte.

Häufig gestellte Fragen

  • Q: Welche Informationen sollte ich bereitstellen, um ein Projekt zur Expression und Reinigung zu starten?

    A: Bitte geben Sie Ihre Zielgen- oder Plasmidsequenz, den gewünschten Expressionswirt, Tag-Präferenzen sowie etwaige bekannte Löslichkeits- oder Stabilitätsprobleme an.

  • F: Können Sie mit membrangebundenen oder unlöslichen Enzymen arbeiten?

    A: Ja. Wir exprimieren und reinigen routinemäßig Membranproteine und unlösliche Enzyme unter Verwendung von Detergensolubilisierung, Refaltungsstrategien und proprietären Puffersystemen.

  • Q: Welche Reinigungstags können Sie unterbringen?

    Wir unterstützen His-, GST-, MBP-, FLAG-, Strep- und benutzerdefinierte Fusions-Tags, mit optionaler Tag-Entfernung durch Protease-Spaltung.

  • F: Wie stellen Sie die Aktivität von gereinigten Mutanten sicher?

    A: Wir minimieren die Denaturierung durch eine Reinigung bei niedrigen Temperaturen und überprüfen die Protein-Faltung mittels SDS-PAGE, zirkulärer Dichroismus oder optionalen enzymatischen Assays.

  • Kann das gereinigte Protein direkt für strukturelle Analysen oder Kinetik verwendet werden?

    A: Ja. Unsere Proteine werden in assay-kompatiblen Puffern und Konzentrationen geliefert, die für Kristallisation, Kryo-EM oder kinetische Studien geeignet sind.

  • Q: Was ist, wenn das mutierte Protein schlecht exprimiert wird?

    Wir bieten mehrere Optimierungsoptionen an – einschließlich alternativer Wirte, Chaperon-Co-Expression und Kodonoptimierung – um Konstrukte mit niedriger Expression zu retten.

Referenzen:

  1. Ertem FB, Guven O, Buyukdag C, u. a.Protokoll zur Strukturaufklärung der Hauptprotease von SARS-CoV-2 bei nahezu physiologischer Temperatur durch serielle Femtosekunden-Kristallographie. STAR-Protokolle2022;3(1):101158. doi:10.1016/j.xpro.2022.101158
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Nur für Forschungs- und Industriezwecke. Nicht für den persönlichen Gebrauch bestimmt. Bestimmte Produkte in Lebensmittelqualität eignen sich für die Formulierungsentwicklung in Lebensmitteln und verwandten Anwendungen.

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