Aktivitätsassays für gezielte Mutagenesemutanten

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Kreative Enzyme bereitstellt Aktivitätsassays für gezielte Mutagenese-Varianten, ein spezialisiertes Downstream-Dienstleistung entwickelt, um die funktionalen Auswirkungen gezielter Mutationen auf die Enzymleistung zu bewerten. Durch die Kombination fortschrittlicher kinetischer Messungen, Substratprofilierung und Hochdurchsatz-Screening-Methoden liefern wir quantitative Einblicke in die katalytische Effizienz, Substratspezifität und regulatorischen Eigenschaften von konstruierten Enzymen. Unsere Plattform unterstützt eine breite Palette von Enzymklassen und Mutationsarten, wodurch Forscher genetische Modifikationen präzise mit funktionalen Ergebnissen korrelieren können. Dieser Service integriert sich nahtlos in die vorangegangenen Mutagenese- und Expressionsabläufe und gewährleistet zuverlässige, reproduzierbare und interpretierbare Aktivitätsdaten für sowohl Forschungs- als auch industrielle Anwendungen.

Hintergrund: Aktivitätsassays für Varianten der gerichteten Mutagenese

Standortgerichtete Mutagenese ist ein leistungsfähiges Werkzeug zum Verständnis der Struktur-Funktions-Beziehungen und zur Verbesserung der Enzym-Eigenschaften, aber Mutationen sind nur dann von Bedeutung, wenn ihre funktionalen Konsequenzen quantifiziert werden. Selbst eine einzige Aminosäure-Substitution kann die Kinetik, die Substratbindung oder die allosterische Regulation erheblich verändern. Ohne sorgfältige Aktivitätscharakterisierung können wertvolle Informationen über Enzymmechanismen und Ingenieurergebnisse verloren gehen.

Um diesem Bedarf gerecht zu werden, bietet Creative Enzymes umfassende Aktivitätsassays an, die hochsensible Detektion, wirtsspezifische Expressionsanalysen und Studien zur Substratvielfalt kombinieren. Egal, ob das Ziel darin besteht, die erhöhte katalytische Effizienz zu überprüfen, die Substratspezifität zu erweitern oder die Temperatur- und pH-Toleranz zu bewerten, unsere Plattform liefert robuste, reproduzierbare und detaillierte enzymatische Daten, um weitere Entwicklungen im Bereich Engineering oder kommerzielle Entwicklungen zu unterstützen.

Rate of reaction of wild-type enzyme and site-directed mutagenesis variants Abbildung 1. Die gerichtete Mutagenese verbessert die Enzymaktivität.

Was wir anbieten

Unsere umfassenden Aktivitätsassay-Dienstleistungen für gentechnisch veränderte Enzyme unter Verwendung von gerichteter Mutagenese umfassen:

Kinetische Assays

Bestimmung von k_Katze, K_M, V_maxund katalytische Effizienz unter definierten Bedingungen mithilfe spektrophotometrischer, fluorometrischer oder chromogener Methoden.

Substratspezifitätsprofilierung

Bewertung der Enzymaktivität gegenüber einem Panel von natürlichen und synthetischen Substraten zur Identifizierung von Selektivitätsänderungen, die durch Mutationen induziert werden.

Kofaktor- und Effektorstudien

Bewertung der Enzymreaktion auf Cofaktoren, Inhibitoren oder Aktivatoren zur Aufklärung der Regulationsmechanismen.

Thermische und pH-Stabilitätstests

Messung der verbleibenden Aktivität über Temperatur- und pH-Gradienten zur Bewertung der Mutationsauswirkungen auf die Umweltverträglichkeit.

Hochdurchsatz-Screening (HTS)

Miniaturisierte Tests für große Mutantenbibliotheken zur effizienten Identifizierung von leistungsstarken Varianten.

Datenanalyse und -interpretation

Quantitative und vergleichende Analyse der Leistung von Mutanten im Vergleich zum Wildtyp, mit umfassender Berichterstattung.

Integration mit gereinigten Proteinen oder groben Lysaten

Analysen, die sowohl an gereinigten Proteinen als auch an Zelllysaten durchgeführt werden, um Flexibilität und hohe Durchsatzgeschwindigkeit zu bieten.

Angepasste Assay-Entwicklung

Entwicklung und Implementierung von Assays, die auf neuartige Enzyme, komplexe Substrate oder industriell relevante Bedingungen zugeschnitten sind.

Service-Workflow

Service workflow of activity assays for site-directed mutagenesis variants

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Service-Details

Parameter	Spezifikation
Analysearten	Spektrophotometrische, fluorometrische, lumineszente, chromogene oder gekoppelte enzymatische Nachweisverfahren
Enzymquellen	Reinige Proteine, Zelllysate oder rekombinante Expressionssysteme
Substratbereich	Natürliche und synthetische Substrate, einschließlich industrieller Analogien
Messbereich	Nachweisgrenzen bis hinunter zu nanomolaren Enzymkonzentrationen
Kinetische Parameter	K_M k_Katze, V_max, katalytische Effizienz, Hemmkonstanten (Ki)
Umweltprofilierung	Aktivität über Temperatur (4–80°C) und pH (3–10) Bereiche
Optionale Zusatzleistungen	Hochdurchsatz-Screening, Cofaktor-/Coenzym-Optimierung, Inhibitor-Profilierung
Liefergegenstände	Roh- und analysierte Daten, grafische Darstellung und detaillierter Tätigkeitsbericht

Verbindung zu umfassenderen Dienstleistungen zur Messung der Enzymaktivität

Neben Assays, die speziell für standortspezifische Mutanten entwickelt wurden, bietet Creative Enzymes auch an umfassende Dienstleistungen zur Messung der Enzymaktivität eine breite Palette von Enzymklassen und Reaktionstypen abdecken. Unser Fachwissen geht über Mutageneseprojekte hinaus und umfasst standardisierte sowie maßgeschneiderte Aktivitätsassays für Oxidoreduktasen, Transferasen, Hydrolasen, Lyasen, Isomerasenund Ligasen.

Diese Tests werden unter streng kontrollierten Bedingungen durchgeführt, um Genauigkeit, Vergleichbarkeit und Reproduzierbarkeit in verschiedenen Forschungs- und Industrieanwendungen sicherzustellen. Ob Sie präzise kinetische Profile von Mutantenvarianten oder Referenzaktivitätsmessungen von Wildtyp-Enzymen benötigen, unsere integrierte Testplattform liefert konsistente, hochwertige Ergebnisse.

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Warum Sie sich für uns entscheiden sollten

Umfassende funktionale Einsicht

Bestimmen Sie die Auswirkungen von Mutationen auf alle relevanten kinetischen und regulatorischen Parameter.

Hohe Empfindlichkeit und Genauigkeit

Nutzen Sie präzise Erkennungsplattformen, um subtile Aktivitätsunterschiede zu erfassen.

Flexible Probenkompatibilität

Assays können an gereinigten Proteinen, Rohextrakten oder Ganzzellpräparaten durchgeführt werden.

Anpassbares Assay-Design

Maßgeschneiderte Protokolle für einzigartige Enzymklassen oder spezialisierte Substrate.

Schnelle Datenverarbeitung

Optimierte Arbeitsabläufe liefern umsetzbare Ergebnisse innerhalb der standardmäßigen Projektzeitrahmen.

Nahtlose Integration mit nachgelagerter Analyse

Ergebnisse können direkt strukturelle Studien, Stabilitätsoptimierung oder Strategien für industrielle Anwendungen leiten.

Fallstudien und praktische Erkenntnisse

Fall 1: Aktivitätscharakterisierung von standortspezifischen Phytase-Mutanten mit verbesserter katalytischer Leistung

Um die katalytische Effizienz und Thermostabilität von Aspergillus niger N25 Phytase, drei rekombinante Mutantenstämme – PP-NPm-8, PP-NPep-6A und I44E/T252R-PhyA – wurden mittels fehleranfälliger PCR und gerichteter Mutagenese konstruiert. Weitere Optimierungen durch gerichtete Evolution und DNA-Shuffling führten zu verbesserten Varianten, darunter T195L/Q368E/F376Y und Q172R/K432R. Letztere zeigte die höchste Thermostabilität, während Q368E/K432R die größte katalytische Aktivität aufwies. Detaillierte Aktivitätsassays bestätigten, dass die fünf identifizierten Substitutionen (Q172R, T195L, Q368E, F376Y, K432R) synergistisch zur verbesserten Enzymleistung beitrugen. Diese konstruierten Phytasemutanten zeigen ein starkes Potenzial für industrielle Anwendungen, insbesondere in Prozessen, die hohe katalytische Effizienz und Wärmebeständigkeit erfordern.

Improved thermostability and enzyme activity of a recombinant phyA mutant phytase from Aspergillus niger N25 by directed evolution and site-directed mutagenesis Abbildung 2. Profile der Thermostabilität, pH und Temperatur im Vergleich zur Aktivität für PP-NP ep-6A Phytase und ihre Mutanten. (Tang u. a.., 2018)

Fall 2: Aktivitätsprofilierung von kälteangepassten WF146-Protease-Mutanten

Durch gerichtete Evolution gefolgt von gezielter Mutagenese wurden kalt-adaptierte Varianten des thermophilen Subtilase WF146-Protease entwickelt, um die Leistung bei niedrigen Temperaturen zu verbessern. Der RTN29-Mutant, der vier Aminosäureaustausche aufweist, zeigte eine sechsfach erhöhte caseinolytische Aktivität bei 15–25 °C und eine Reduktion der optimalen Temperatur um 15 °C, während er nach einer Wärmebehandlung bei 60 °C teilweise die Thermostabilität behielt. Detaillierte Aktivitätsassays zeigten einen Kompromiss zwischen Stabilität und katalytischer Effizienz, wobei RTN29 eine veränderte Substratspezifität aufgrund von Mutationen in der Nähe des Substratbindungsbereichs aufwies. Strukturelle Analysen bestätigten eine erhöhte Flexibilität und modulierte Substrataffinität, was mechanistische Einblicke in die Anpassung des Enzyms für kaltaktive Katalyse in industriellen Anwendungen bietet.

Improvement of low‐temperature caseinolytic activity of a thermophilic subtilase by directed evolution and site‐directed mutagenesis Abbildung 3. Die caseinolytischen Aktivitäten von WT und den Varianten bei 25 °C in Abhängigkeit von der Zeit. A: Das Reaktionsgemisch enthält 1% Kasein und 1,5 mg/mL jedes Enzyms in 50 mM Tris–HCl-Puffer (pH 8,0) mit 10 mM CaCl.₂ und 10 mM NaCl wurde bei 25 °C inkubiert. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurde die Absorption des Hydrolysatsupernatants nach TCA-Fällung bei 280 nm gemessen. B: Zeitverlauf der Hydrolyse von 0,0625% (□), 0,5% (●) oder 1% (Δ) Kasein. (Zhong u. a.., 2009)

Häufig gestellte Fragen

Q: Können Sie jede Art von Enzym untersuchen?

A: Ja. Wir unterstützen Hydrolasen, Oxidoreduktasen, Transferasen, Lyasen, Isomerasen, Ligasen und mehr, unter Verwendung maßgeschneiderter Substrate und Nachweismethoden.
Q: Arbeiten Sie sowohl mit gereinigtem Protein als auch mit rohen Lysaten?

A: Ja. Assays können entweder für gereinigte Proteine oder rekombinante Zelllysate angepasst werden, um Flexibilität und schnelles Screening zu ermöglichen.
Q: Können Sie Hochdurchsatz-Screenings für große Mutantenbibliotheken durchführen?

A: Absolut. Wir haben miniaturisierte Plattformen für 96- und 384-Well-Formate, um große Variantenbibliotheken effizient zu bewerten.
Welche kinetischen Parameter werden gemessen?

A: Wir messen K_M, k_Katze, V_maxkatalytische Effizienz, Inhibitionskonstanten und Substrat/Kofaktor-Spezifität.
Q: Können die Tests nicht-natürliche Substrate oder industrielle Analoga berücksichtigen?

A: Ja. Wir entwerfen und validieren Tests für natürliche, synthetische und industriell relevante Substrate.
F: Wie werden die Ergebnisse berichtet?

A: Kunden erhalten Rohdaten, analysierte Tabellen, kinetische Diagramme und einen umfassenden Aktivitätsbericht, der für die Veröffentlichung oder industrielle Überprüfung geeignet ist.

Referenzen:

Tang Z, Jin W, Sun R, u. a.Verbesserte Thermostabilität und Enzymaktivität einer rekombinanten PhyA-Mutanten-Phytase aus Aspergillus niger N25 durch gerichtete Evolution und gezielte Mutagenese. Enzym- und Mikrobiotechnologie. 2018;108:74-81. doi:10.1016/j.enzmictec.2017.09.010
Zhong C, Song S, Fang N, u. a.Verbesserung der Kälte-Caseinolyse-Aktivität einer thermophilen Subtilase durch gerichtete Evolution und gerichtete Mutagenese. Biotechnologie & Bioingenieurwesen. 2009;104(5):862-870. doi:10.1002/bit.22473

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Projektbeschreibung:

Nur für Forschungs- und Industriezwecke. Nicht für den persönlichen Gebrauch bestimmt. Bestimmte Produkte in Lebensmittelqualität eignen sich für die Formulierungsentwicklung in Lebensmitteln und verwandten Anwendungen.

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