Template-DNA-Sequenzierung für die gerichtete Mutagenese

Anfrage

Template-DNA-Sequenzierung ist ein kritischer vorgelagerter Schritt in Enzymtechnik durch gerichtete Mutagenese (SDM)Die genaue Sequenzierung der elterlichen (Template-)DNA stellt sicher, dass Mutationen in einen verifizierten und fehlerfreien genetischen Hintergrund eingeführt werden, wodurch das Risiko von falsch-positiven Ergebnissen oder nachgelagerten Ausdrucksfehlern ausgeschlossen wird. Bei Kreative EnzymeWir bieten hochpräzise Sequenzierungs- und Verifizierungsdienste an, die darauf ausgelegt sind, die Integrität, Identität und Einsatzbereitschaft der Template-DNA vor der Mutagenese zu bestätigen. Dieser Service garantiert ein präzises Mutationsdesign, eine zuverlässige Konstrukterstellung und einen reibungslosen Übergang in die Klonierungs- und Expressionsphasen.

Template-DNA-Sequenzierung: Die Grundlage des SDM-Workflows

Standortgerichtete Mutagenese ist ein leistungsstarkes molekulares Werkzeug für Enzymtechnik, was eine präzise Modifikation von Aminosäureresten ermöglicht, um die katalytische Aktivität, Stabilität oder Substratspezifität zu verbessern. Der Erfolg der SDM hängt jedoch grundlegend von der Qualität der Ausgangs-DNA-Vorlage ab. Selbst geringfügige Sequenzabweichungen oder unentdeckte Polymorphismen können zu unbeabsichtigten Mutationen, beeinträchtigter Enzymfunktion oder experimentellen Inkonsistenzen führen.

Daher, Vorlage DNA-Sequenzierung dient als Grundlage für einen robusten SDM-Workflow. Durch die Validierung der gesamten Gensequenz und ihres Vektor-Kontexts vor der Einführung von Mutationen können Forscher die experimentelle Genauigkeit und Reproduzierbarkeit sicherstellen. Creative Enzymes integriert fortschrittliche Sequenzierungstechnologien und strenge bioinformatische Validierung, um zu bestätigen, dass jede Vorlage, die für die Mutagenese verwendet wird, den höchsten Qualitätsstandards entspricht.

A simplified workflow of a site-directed mutagenesis strategy, starting with template DNA sequencing Abbildung 1. Eine strategie zur gezielten Mutagenese. Der erste Schritt besteht darin, die Template-DNA vorzubereiten. u. a.., 2003)

Vorlagen für DNA-Sequenzierungsdienste

Creative Enzymes bietet eine umfassende Sequenzierungs- und Validierungslösung, die auf Projekte zur Enzymtechnik basierend auf Mutagenese zugeschnitten ist. Unser Service umfasst:

Umfassende Vorlage zur DNA-Überprüfung, einschließlich der vollständigen Gen-Sequenzierung und der Bestätigung des Vektor-Rückgrats.
Fehlerfreie Sequenzvalidierung unter Verwendung von Doppelstrang- und hochgradigen Reads.
Sequenzalignment und Annotation gegen Referenz- oder Entwurfssequenzen.
Qualitätsbewertung und Berichtserstellungeinschließlich der Analyse von Chromatogrammen und der Vertrauensbewertung.
Optionale Plasmidreinigung und Qualitätskontrolle vor der downstream Mutagenese.
Angepasste Sequenzierungsstrategie (Sanger oder NGS) entsprechend der Vorlagengröße und -komplexität.

Service-Workflow

Service workflow of template DNA sequencing for site-directed mutagenesis

Service-Details

Parameter	Spezifikation
Akzeptierte Probenarten	Plasmid-DNA, PCR-Produkte, synthetische Gene
Empfohlene Konzentration	≥100 ng/µL (Plasmid); ≥50 ng/µL (PCR-Produkt)
Reinheitsanforderung	A260/A280-Verhältnis von 1,8–2,0
Durchlaufzeit	Typischerweise 3–5 Werktage
Liefergegenstände	Verifizierte DNA-Sequenz und Chromatogramme Qualitätsbewertungszusammenfassung (Abdeckung, Genauigkeit, Basisaufrufvertrauen) Sequenzalignment und Zertifikat zur Mutationsbereitschaft
Optionale Zusatzleistungen	Gensynthese aus verifiziertem Sequenz Subklonierung in Expressionsvektoren Speicherung und Dokumentation von verifizierten Vorlagen für die zukünftige Verwendung

Was uns auszeichnet

Hochgenauigkeits-Sequenzierung

Die Dual-Plattform-Sequenzierung (Sanger + NGS) gewährleistet eine Basisgenauigkeit und -zuversicht.

Experte für Bioinformatik

Umfassende Sequenzvalidierung und vergleichende Ausrichtung durch erfahrene Molekularbiologen.

Nahtlose Integration

Vollständig kompatibel mit unseren site-directed Mutagenese- und Expressionsdiensten, was die Kontinuität des Projekts optimiert.

Angepasste Strategien

Flexibles Primer-Design, Sequenzierungsabdeckung und analytische Tiefe, die auf die Projektbedürfnisse zugeschnitten sind.

Schnelle Bearbeitung und zuverlässige Lieferung

Effiziente Logistik und Projektmanagement minimieren die Wartezeit.

Umfassende Datenberichterstattung

Klare, veröffentlichungsbereite Sequenzierungsberichte mit vollständiger Rückverfolgbarkeit und Zertifizierung.

Vorlage DNA-Sequenzierung für SDM: Fallstudien

Fall 1: Vorlagenüberprüfung zur Vermeidung von nachgelagerten Mutationsfehlern

Kundenbedarf:

Ein Forschungsteam, das plant, mehrere Punktmutationen in ein Hydrolase-Gen einzuführen, plante eine Reihe von Struktur-Funktions-Studien. Bevor sie mit der gerichteten Mutagenese (SDM) begannen, baten sie um eine Sequenzverifizierung ihres Plasmid-Templates, um die experimentelle Genauigkeit sicherzustellen.

Unser Ansatz:

Wir führten eine vollständige Plasmid-Sanger-Sequenzierung mit überlappenden Primer-Sets durch, um eine vollständige Abdeckung des kodierenden Bereichs und der angrenzenden regulatorischen Elemente sicherzustellen. Unsere Analyse entdeckte zwei unerwartete stille Polymorphismen und, noch kritischer, eine Einzelbasenlöschung innerhalb des offenen Leserahmens – ein Fehler, der den Leserahmen verschoben und alle geplanten Mutationen gefährdet hätte. Nach der Meldung der Abweichungen synthetisierten wir die korrekte Gen-Sequenz neu und klonten sie erneut, um dem Kunden eine vollständig validierte Vorlage für die SDM bereitzustellen.

Ergebnis:

Mit dem korrigierten Konstrukt hat der Kunde erfolgreich alle beabsichtigten Mutanten erzeugt, die jeweils eine korrekte Faltung und die erwartete Hydrolase-Aktivität aufweisen.

Fall 2: Hochdurchsatz-Template-Screening für parallele Mutagenese

Kundenbedarf:

Ein Biotechnologiepartner, der an thermostabilen Oxidoreduktasen arbeitet, wollte eine parallele Mutagenese über ein Panel von 40 Enzymvarianten durchführen. Da die Konstrukte aus verschiedenen Klonierungsbatches stammten, benötigte das Team eine schnelle und zuverlässige Sequenzvalidierung, bevor es mit hochdurchsatzfähigen Ingenieur- und Expressionstests beginnen konnte.

Unser Ansatz:

Wir haben einen Hochdurchsatz-Sequenzierungsworkflow im 96-Well-Plattenformat implementiert, der die gleichzeitige Verarbeitung aller 40 Plasmide ermöglicht. Automatisierte Template-Vorbereitung, optimiertes Primer-Design und multiplexe Sanger-Sequenzierung ermöglichten die vollständige Verifizierung der kodierenden Sequenzen innerhalb von fünf Tagen. Jede Sequenz wurde auf Punktmutationen, Frameshifts, Trunkierungen und unbeabsichtigte Klonierungsartefakte analysiert. Verifizierte Konstrukte wurden in eine qualitätsgeprüfte Template-Bibliothek zusammengestellt, die bereit für nachgelagerte Mutagenese ist.

Ergebnis:

Das validierte Template-Set ermöglichte es dem Kunden, direkt mit paralleler Mutagenese und Expressionsscreening fortzufahren. Nachfolgende Assays identifizierten mehrere Oxidoreduktase-Varianten mit signifikant verbesserter Thermostabilität.

Vorlage DNA-Sequenzierung für SDM: Häufig gestellte Fragen

Q: Warum ist die Template-DNA-Sequenzierung notwendig, bevor eine gezielte Mutagenese durchgeführt wird?

A: Die Sequenzierung stellt sicher, dass die elterliche DNA die beabsichtigte Wildtyp-Sequenz genau repräsentiert. Fehler oder Polymorphismen in der Vorlage können zu fehlgeschlagener Mutagenese oder falscher Proteinexpression führen.
F: Welche Sequenzierungsmethoden verwenden Sie?

Wir setzen sowohl die Sanger-Sequenzierung für kurze bis mittellange Gene als auch die Next-Generation-Sequenzierung (NGS) für komplexe oder lange Vorlagen ein, um vollständige Abdeckung und Präzision zu gewährleisten.
Q: Wie viel DNA sollte ich einreichen?

A: Typischerweise sind 10–20 µg hochreiner Plasmid-DNA oder 200–500 ng PCR-Produkt ausreichend für die Sequenzierung und Qualitätskontrolle.
F: Können Sie GC-reiche oder repetitive Regionen sequenzieren?

A: Ja. Wir verwenden optimierte Chemie- und Primerdesign-Strategien, um schwierige Regionen zu überwinden und zuverlässige Ergebnisse zu gewährleisten.
Q: Werden Sie eine Aufzeichnung meiner verifizierten Sequenz führen?

A: Ja. Mit Zustimmung des Kunden speichern wir sicher validierte Sequenzen und Dokumentationen, um zukünftige Mutagenese- oder Expressionsprojekte zu erleichtern.
Q: Kann dieser Service mit Ihrem Mutagenese-Workflow kombiniert werden?

A: Absolut. Die Template-Sequenzierung ist vollständig in unsere upstream-Dienste für die standortgerichtete Mutagenese integriert, sodass verifizierte Konstrukte sofort bereit für die Einführung von Mutationen und nachgelagerte Anwendungen sind.

Referenzen:

Allemandou F, Nussberger J, Brunner HR, Brakch N. Schnelle ortsgerichtete Mutagenese unter Verwendung von zwei durch PCR erzeugten DNA-Fragmenten, die die Plasmidvorlage reproduzieren. BioMed Forschungsinternational2003;2003(3):202-207. doi:10.1155/S1110724303209141

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Nur für Forschungs- und Industriezwecke. Nicht für den persönlichen Gebrauch bestimmt. Bestimmte Produkte in Lebensmittelqualität eignen sich für die Formulierungsentwicklung in Lebensmitteln und verwandten Anwendungen.

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