Klonen in Expressionsvektoren für die gerichtete Mutagenese

Anfrage

Kreative Enzyme bereitstellt Klonen in Expressionsvektoren als engagierter Upstream-Service für die zielgerichtete Mutagenese (SDM) Workflows. Unser Klonservice stellt sicher, dass synthetisierte oder verifizierte Gene präzise in optimierte Expressionssysteme eingefügt werden, was die Grundlage für genaue Mutagenese und nachgelagerte Proteinproduktion bildet. Durch den Einsatz von hochpräzisen Klonstrategien, fortschrittlichem Vektordesign und rigoroser Sequenzvalidierung garantieren wir Kompatibilität, Effizienz und Reproduzierbarkeit. Ob Ihr Ziel darin besteht, einen einzelnen Mutanten oder eine umfangreiche Variantenbibliothek zu erzeugen, unsere Klonexpertise sorgt für einen nahtlosen Übergang vom Design zur funktionalen Expression.

Genklonierung: Ein kritischer und präziser Schritt in der SDM

Effizientes und genaues Genklonen ist entscheidend für den Erfolg von Enzymengineering- und gezielten Mutageneseprojekten. Schlecht optimierte Vektoren, unbeabsichtigte Mutationen oder suboptimale Promotoren können die Expressionserträge, die Faltungseffizienz und die experimentelle Reproduzierbarkeit beeinträchtigen. Daher ist die Etablierung eines mutationsbereiten Expressionskonstrukts ein entscheidender erster Schritt vor jedem SDM-Verfahren.

Der Arbeitsablauf für Klonen in Expressionsvektoren Die Enzymtechnik durch gerichtete Mutagenese (SDM) ist ein grundlegender und präziser Prozess. Er stellt sicher, dass das mutierte Gen, das Sie erstellt haben, in einen Vektor eingefügt wird, der in eine Wirtszelle eingeführt werden kann (wie E. coli) um große Mengen des mutierten Proteins zur Analyse zu produzieren.

Bei Creative Enzymes bieten wir umfassende Vektorklonierungsdienste, die auf Ihr Zielenzym und den Expressionswirt zugeschnitten sind. Unser technisches Team integriert Bioinformatikanalyse, Sequenzoptimierung und Klonierungsdesign um Konstrukte zu erstellen, die nicht nur mit Ihrer Mutagenesestrategie kompatibel sind, sondern auch für die Expression in bakteriellen, Hefen-, Insekten- oder Säugetiersystemen optimiert sind.

A simplified workflow of a site-directed mutagenesis strategy involves gene cloning after template DNA sequencing and gene synthesis Abbildung 1. Eine strategie zur gezielten Mutagenese. Nach der Vorbereitung der Template-DNA und der Synthese der Mutation wird ein mutationsbereiter Expressionskonstrukte erstellt. u. a.., 2003)

Was wir anbieten

Unser Genklonierungsverfahren für die gezielte Mutagenese umfasst:

Benutzerdefinierte Vektorkonstruktion

Maßgeschneidertes Design und Klonen für E. coliHefe-, Insekten- oder Säugetiersysteme zur Unterstützung verschiedener SDM-Anwendungen.

Mehrere Klonierungsstrategien

Beinhaltet Restriktionsenzym-Klonierung, nahtlose Klonierung, Gibson-Assembly und standortspezifische Rekombination.

Vektoroptimierung

Anpassbare Promotoren, Selektionsmarker und Fusions-Tags zur Maximierung der Expression und Kompatibilität.

Einfügung von synthetisierten oder bestehenden Genen

Integration von verifizierten oder de novo synthetisierten Genen in vorvalidierte Expressionsvektoren.

Sequenzierungsüberprüfung und Qualitätskontrolle

Umfassende Konstruktvalidierung mittels Kolonie-PCR, Restriktionsverdau und vollständiger Sanger-Sequenzierung.

Fertige Plasmide

Hochreine, mutationsbereite Plasmide, geliefert mit Sequenzberichten und annotierten Vektorkarten.

Optionale Bibliothekskonstruktion

Hochdurchsatzgenerierung von kombinatorischen oder Multi-Standort-Mutagenesebibliotheken zur Screening von Enzymvarianten.

Vektorkartenannotierung und Dokumentation

Detaillierte, veröffentlichungsbereite Karten und Sequenzannotationen für klare Nachverfolgbarkeit und Datenintegration in zukünftigen Experimenten.

Service-Workflow

Service workflow of cloning into expression vectors for site-directed mutagenesis

Service-Details

Parameter	Spezifikation
Klonungsmethoden	Restriktionsenzym-Klonierung, nahtlose Klonierung, Gibson-Assembly, standortspezifische Rekombination
Host-Systeme	E. coli, Bacillus, PichiaInsekt, Säugetier
Vektoroptionen	Standard oder individuell, mit Flexibilität bei Tags/Promotions/Markierungen
Größe einfügen	Bis zu 10 KB (größere auf Anfrage erhältlich)
QC-Methoden	Sanger-Sequenzierung, Restriktionsverdau, Kolonie-PCR
Liefergegenstände	Verifiziertes Plasmid-DNA (≥2 µg), Sequenzbericht, annotierte Vektorkarte

Warum uns wählen

Umfassendes Vektorportfolio

Zugang zu einer breiten Palette von Expressionsvektoren, die für verschiedene Wirte und Anwendungen geeignet sind.

Hochpräzise Klonierung

Nahtlose Integration von Einsätzen ohne unerwünschte Mutationen oder Leserasterverschiebungen.

Garantierte Kompatibilität

Konstrukte, die für den direkten Einsatz in der Mutagenese und Expression validiert wurden.

Flexible Design-Optionen

Anpassbare Promotoren, Fusionsmarker und Selektionsmarker.

Qualitätssicherung in jedem Schritt

Vollständige Sequenzierungsüberprüfung und Funktionalitätsprüfung.

Integration mit Upstream-Diensten

Vollständig kompatibel mit unseren Angeboten zur Gensynthese und Sequenzierung für optimierte Arbeitsabläufe.

Fallstudien

Fall 1: Optimiertes Klonen für verbesserte Expression in Bacillus

Kundenbedarf:

Ein Biotechnologieunternehmen strebte an, eine thermostabile Xylanase durch gezielte Mutagenese (SDM) zu entwickeln, um die Effizienz der industriellen Biomasseabbau zu verbessern. Ihr anfänglicher Konstrukt zeigte jedoch eine schlechte Expression in Bacillus subtilis, wahrscheinlich aufgrund von Inkompatibilität zwischen dem E. coli-basierter Expressionsvektor und Bacillus Transkriptionsmaschinerie. Niedrige Enzymausbeute erschwerte die anschließende Mutagenese und kinetische Screening.

Unser Ansatz:

Wir haben das gesamte Klonierungsframework neu gestaltet. Wir haben ein kodon-optimiertes Xylanase-Gen synthetisiert, das speziell für B. subtilis und in ein subkloniert Bacillus Shuttle-Vektor ausgestattet mit einem starken konstitutiven Promotor und einem nativen Signalpeptid für die Sekretion. Die Klonierungsstrategie wurde durch Sequenzierung und Kleinmaßstab-Expressionstests verifiziert.

Ergebnis:

Die optimierte Konstruktion führte zu einem 6,3-fachen Anstieg des löslichen Enzymausstoßes und einer robusten Sekretionseffizienz. Dieser Durchbruch ermöglichte ein Hochdurchsatz-SDM-Screening und die Identifizierung mehrerer thermostabiler Varianten, die später erfolgreich in der Pilotfermentation hochskaliert wurden, mit reproduzierbaren Aktivitätsprofilen.

Fall 2: Multi-Standort-Mutagenese-Bibliotheksklonierung zur Enzymoptimierung

Kundenbedarf:

Eine Forschungsgruppe an der Universität hatte zum Ziel, den katalytischen Mechanismus eines Dehydrogenase-Enzyms zu untersuchen, indem sie mehrere Punktmutationen rund um die aktive Stelle einführte. Die herkömmliche Klonierung von Einzelmutanten war langsam und anfällig für Rekombinationsfehler, was ihren Zeitplan für das funktionale Screening verzögerte.

Unser Ansatz:

Wir haben eine modulare Hochdurchsatz-Klonierungsstrategie unter Verwendung der Gibson-Assembly implementiert. Wir haben mutationsbereite synthetische Genfragmente entworfen und sie in einen hochkopierten pET-Vektor unter einem T7-Promotor eingebaut. Jede Variante wurde parallel unter Verwendung eines automatisierten Flüssigkeitshandhabungssystems konstruiert, und alle Plasmide wurden vor der Expression sequenzverifiziert.

Ergebnis:

Der Kunde erwarb innerhalb von drei Wochen eine vollständige Bibliothek von 96 korrekt zusammengebauten Varianten – weniger als die Hälfte der erwarteten Projektdauer. Hochdurchsatz-Expression und kinetisches Screening identifizierten mehrere Mutanten, die bis zu 2,8-fache Verbesserungen in der katalytischen Effizienz aufwiesen. Das modulare Design dient nun als wiederverwendbare Plattform für zukünftige Studien zur Enzymtechnik.

Häufig gestellte Fragen

Q: Kannst du in benutzerdefinierte oder proprietäre Vektoren klonen?

A: Ja. Wir können mit vom Kunden bereitgestellten Vektoren arbeiten oder vollständig maßgeschneiderte Rückgrate entwerfen, die mit Ihrem Mutagenese-Workflow kompatibel sind.
F: Was ist, wenn mein Insert oder Vektor komplexe Sequenzen aufweist (z. B. hohe GC-Gehalte oder Wiederholungen)?

A: Unser Team verwendet optimierte Klonstrategien und spezialisierte Polymerasen, um schwierige Sequenzen mit hoher Genauigkeit zu bearbeiten.
F: Kann ich mehrere Mutationen in einem einzigen Klonierungsschritt kombinieren?

A: Ja. Durch modulare Klonierung oder Gibson-Assembly können mehrere Standortmutationen gleichzeitig eingeführt werden, um eine hochdurchsatzfähige Variantenproduktion zu ermöglichen.
Q: Welche Expressionssysteme werden unterstützt?

A: Wir unterstützen eine vollständige Palette von Hosts, einschließlich E. coli, Bacillus, Pichia pastorisInsekten- und Säugetierzellen.
F: Wie bestätigen Sie eine erfolgreiche Klonierung?

Jede Konstruktion wird vor der Lieferung durch Kolonie-PCR, Restriktionsverdau und vollständige Sanger-Sequenzierung verifiziert.
F: Kann dieser Service direkt mit meinem nachgelagerten Mutagenese- oder Expressionsworkflow integriert werden?

A: Absolut. Unser Klonierungsservice ist so konzipiert, dass er nahtlos mit unseren SDM- und Proteinexpressions- sowie Reinigungsdiensten integriert wird, um eine einheitliche Pipeline von Gen zu Funktion bereitzustellen.

Referenzen:

Allemandou F, Nussberger J, Brunner HR, Brakch N. Schnelle standortgerichtete Mutagenese unter Verwendung von zwei durch PCR erzeugten DNA-Fragmenten, die die Plasmidvorlage reproduzieren. BioMed Forschungsinternational. 2003;2003(3):202-207. doi:10.1155/S1110724303209141

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Nur für Forschungs- und Industriezwecke. Nicht für den persönlichen Gebrauch bestimmt. Bestimmte Produkte in Lebensmittelqualität eignen sich für die Formulierungsentwicklung in Lebensmitteln und verwandten Anwendungen.

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