Messung der Enzymaktivität der 4‑Hydroxybenzoat‑3‑Monooxygenase

Mit langjähriger Erfahrung in der Entwicklung und Optimierung enzymatischer Assays hat sich Creative Enzymes zu einem der zuverlässigsten Dienstleister für Enzymaktivitätsmessungen auf dem globalen Markt entwickelt. Unser Leistungsspektrum ist umfassend und deckt sämtliche Aspekte der Enzymaktivitätsquantifizierung für eine Vielzahl unterschiedlicher Enzymtypen ab. Creative Enzymes ist stolz darauf, einen zuverlässigen Enzymaktivitätsassay für 4‑Hydroxybenzoat‑3‑Monooxygenase anzubieten.

4‑Hydroxybenzoat‑3‑Monooxygenase (EC 1.14.13.2; 4‑hydroxybenzoate,NADPH:oxygen oxidoreductase (3‑hydroxylating)) ist der Prototyp einer großen Familie pyridinnukleotidabhängiger Flavoprotein‑Monooxygenasen. Dieses Enzym katalysiert den Einbau eines Dioxygenatoms in p-Hydroxybenzoat (p-OHB) zur Bildung von 3,4‑Dihydroxybenzoat (3,4‑DOHB). Die durch 4‑Hydroxybenzoat‑3‑Monooxygenase vermittelte Umwandlung von 4‑Hydroxybenzoat ist eine mehrstufige Reaktion mit drei Substraten und drei Produkten. In der ersten Halbreaktion binden p-OHB und NADPH an das Enzym, und NADPH reduziert den FAD‑Kofaktor. In den anschließenden oxidativen Reaktionen reagiert das reduzierte Flavin mit Sauerstoff zur Bildung von Flavin‑C4a‑Hydroperoxid; der distale Sauerstoff des Hydroperoxids wird auf Position 3 des Substrats übertragen.

Die Analyse der Struktur‑Funktions‑Beziehungen der 4‑Hydroxybenzoat‑3‑Monooxygenase hat die Bedeutung konformationeller Änderungen für den katalytischen Mechanismus aufgezeigt. Eine kontrollierte Katalyse wird durch die Bewegung von Flavin und Protein zwischen drei Konformationen erreicht: „in“, „out“ und „open“. Die „open“-Konformation ist entscheidend für Substratbindung und Produktfreisetzung, die „in“-Konformation für die Reaktion mit molekularem Sauerstoff und die Hydroxylierung, und die „out“-Konformation für die Reduktion von FAD durch NADPH. Darüber hinaus ist zu beachten, dass die Struktur der 4‑Hydroxybenzoat‑3‑Monooxygenase ungewöhnlich ist, da keine erkennbare Domäne für die Bindung von NADPH vorhanden ist, die an der Reaktion beteiligt wäre.

Abbildung: Die Kristallstruktur der 4‑Hydroxybenzoat‑3‑Monooxygenase aus Pseudomonas aeruginosa.
PDB: 1K0I

Da der Aktivierungsmechanismus der durch 4‑Hydroxybenzoat‑3‑Monooxygenase katalysierten Reaktion unklar ist und die reduktive Reaktion unter Beteiligung von NADPH weiterhin nicht vollständig aufgeklärt ist, kann der Aktivitätsassay dieses Enzyms anspruchsvoll und komplex sein. Zur Lösung dieser herausfordernden Fragestellung bietet Creative Enzymes einen professionellen Enzymaktivitätsassay für 4‑Hydroxybenzoat‑3‑Monooxygenase an, um Hürden für die weitere Entwicklung und Forschung zu beseitigen. Wir verwenden eine zuverlässige spektrophotometrische Methode zur Bestimmung der Enzymaktivität, indem wir den Verbrauch von NADPH bei 340 nm überwachen.

Creative Enzymes ist in der Lage, gemeinsam mit unseren Kunden spezifische Fragestellungen zu lösen, die bei der Enzymaktivitätsmessung auftreten. Die enge Zusammenarbeit mit unseren Kunden ist ein integraler Bestandteil unseres Service, und viele Kunden sind uns seit vielen Jahren treu. Insgesamt verpflichtet sich Creative Enzymes, ein Höchstmaß an Kundenzufriedenheit zu erreichen und Produkte, Dienstleistungen sowie das Qualitätsmanagementsystem kontinuierlich zu verbessern.