Kinasen-Substrat-Bibliotheken

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Kinasen spielen zentrale Rollen in der zellulären Signalübertragung und bei Krankheitsmechanismen und sind daher besonders wertvolle Ziele für die Wirkstoffforschung und Enzymcharakterisierung. Bei Creative Enzymes bietet unser Service für Kinase-Substratbibliotheken maßgeschneiderte Sammlungen von Peptidsubstraten und Analoga, die darauf ausgelegt sind, die Kinaseaktivität, Substratspezifität und Regulationsmechanismen umfassend zu profilieren. Durch die Kombination rationaler Bibliothekskonstruktion mit Assay-Kompatibilität ermöglichen wir eine präzise Substratidentifizierung und einen effizienten Übergang zu nachgelagerten Anwendungen wie Inhibitor-Screening und mechanistischen Studien.

Hintergrund zur Konstruktion von Kinase-Substratbibliotheken

Die Konstruktion von Kinase-Substratbibliotheken ist ein spezialisierter und entscheidender Prozess in der funktionellen Proteomik und Wirkstoffforschung. Kinasen, Enzyme, die die Übertragung einer Phosphatgruppe auf spezifische Substrate katalysieren, sind zentrale Regulatoren nahezu aller zellulären Prozesse. Die Identifizierung ihrer optimalen Substrate ist essenziell, um Signalnetzwerke, Krankheitsmechanismen und die Entwicklung gezielter Therapien zu verstehen.

Die besondere Herausforderung der Kinase-Substratidentifizierung

Im Gegensatz zu vielen Enzymen zeigen Kinasen eine hohe Spezifität nicht nur für ein primäres Sequenzmotiv, sondern auch für strukturelle und kontextuelle Merkmale rund um die Phosphorylierungsstelle. Dies macht die Suche nach dem „besten Substrat“ besonders komplex. Ein optimales Kinase-Substrat zeichnet sich aus durch:

Hohe katalytische Effizienz (k_cat/K_M)
Hohe Spezifität (minimale Off-Target-Phosphorylierung)
Biologische Relevanz (entspricht der tatsächlichen physiologischen Rolle)

Warum spezialisierte Kinase-Substratbibliotheken erstellen?

Die Identifizierung geeigneter Kinase-Substrate ist entscheidend für:

Die Etablierung robuster Kinase-Assays für das High-Throughput-Inhibitor-Screening.
Die Definition der Substratselektivität, um Signalwege besser zu verstehen.
Die Charakterisierung neuer oder wenig erforschter Kinasen mit unbekannten biologischen Substraten.

Aufgrund der Vielfalt der Kinasefamilien und ihrer Substraterkennungsmuster bieten rational entworfene Substratbibliotheken eine praktische Lösung, um Aktivität zu kartieren und zuverlässige Assaysysteme zu etablieren. Unser Service schließt die Lücke zwischen breit angelegtem Aktivitätsscreening und präziser Substratidentifizierung, sodass Kunden ihre kinasefokussierte Forschung mit Zuversicht vorantreiben können.

Unser Ansatz zur Identifizierung von Kinase-Substraten

Bei Creative Enzymes bieten wir sowohl etablierte als auch kundenspezifische Strategien zur Identifizierung von Kinase-Substraten an. Ein häufig verwendeter Ansatz umfasst orientierte Peptidbibliotheken, die auf Phosphorylierungsstellen (Ser, Thr oder Tyr) zentriert sind. Durch in vitro Kinase-Assays definieren wir die Substratspezifität, reichern Phosphopeptide an und analysieren sie und generieren detaillierte Phosphorylierungsmotive. Diese Motive können dann für Datenbanksuchen oder zur Entwicklung phosphomotiv-spezifischer Antikörper verwendet werden, was eine präzise Identifizierung von Kandidaten-Substraten ermöglicht.

Über diese Standardmethodik hinaus arbeiten wir eng mit unseren Kunden zusammen, um Ansätze individuell anzupassen, zu optimieren oder völlig neue Strategien für spezifische Projektanforderungen zu entwickeln.

Schematic diagram showing how protein kinase substrates are identified Abbildung 1. Schematische Darstellung der Identifizierung von Substraten von Proteinkinasen. (Manning und Cantley, 2002)

Was wir anbieten

Unser Service zur Konstruktion von Kinase-Substratbibliotheken ist darauf ausgelegt, Forschenden die Präzision und Flexibilität zu bieten, die sie für die detaillierte Untersuchung von Phosphorylierungsereignissen benötigen. Wir bieten umfassende Optionen, die sowohl Entdeckungs- als auch angewandte Forschungsziele abdecken:

Vordefinierte Bibliotheken von Konsensusmotiven

Gebrauchsfertige Peptidbibliotheken, die kanonische Phosphorylierungsmotive für wichtige Kinasefamilien (z. B. MAPKs, CDKs, Tyrosinkinasen) repräsentieren. Diese Bibliotheken bieten einen schnellen Einstiegspunkt für die Assay-Entwicklung und Aktivitätsscreenings.

Kundenspezifische, motivbasierte Bibliotheken

Substrate, die speziell für die Kinase von Interesse des Kunden entwickelt wurden, basierend auf bekannten Konsensussequenzen, Strukturmodellierung und Sequenzabgleich mit verwandten Enzymen. Dieser Ansatz erhöht die Wahrscheinlichkeit biologisch relevanter Treffer für neue oder wenig erforschte Kinasen.

Erweiterte Variantenbibliotheken

Bibliotheken, die systematisch Aminosäurepositionen um die Phosphorylierungsstelle (z. B. –5 bis +5 Positionen) variieren, um die Substratspezifität zu untersuchen. So können sowohl erwartete als auch unkonventionelle Substratpräferenzen aufgedeckt werden.

Multiplex-Assay-kompatible Formate

Substrate können mit spezifischen Markierungen (z. B. Fluoreszenz-Tags, FRET-Paare, Biotinylierung) synthetisiert oder für unlabeled Nachweis über LC-MS oder antikörperbasierte Methoden ausgelegt werden. Dies gewährleistet die Kompatibilität mit High-Throughput-, Echtzeit- oder Endpunkt-Assays.

Optionen für Peptidlänge und Modifikation

Wir bieten sowohl kurze lineare Peptide für schnelles Screening als auch längere Sequenzen, die native Proteinsubstrate besser nachahmen. Modifikationen wie Phosphorylierung an Kontrollstellen oder die Einbeziehung nicht-natürlicher Aminosäuren sind verfügbar, um das experimentelle Design zu erweitern.

Phosphorylierungs-Benchmark-Standards

Zusätzlich zu neuen Bibliotheken liefern wir positive und negative Kontrollpeptide (validierte Kinase-Substrate und nicht-phosphorylierbare Analoga), um Benchmarking und Reproduzierbarkeit beim Assay-Setup zu ermöglichen.

Qualitätskontrolle und Dokumentation

Alle Peptide werden mit analytischer Validierung (HPLC, MS) und vollständiger Dokumentation einschließlich Sequenz, Reinheit und empfohlenen Assay-Bedingungen geliefert.

Integration mit nachgelagerten Services

Bibliotheken sind für den nahtlosen Übergang in unsere High-Throughput-Screening- und computergestützten Modellierungsservices konzipiert und unterstützen einen End-to-End-Workflow von der Substratidentifizierung bis zur Inhibitorauswahl.

Zentrale Strategien für das Design von Kinase-Substratbibliotheken

Strategie	Beschreibung	Anwendung & Stärke
Positions-Scanning-Peptidbibliotheken (PSPL)	Eine degenerierte Bibliothek, bei der jede Position in einem Peptid fester Länge systematisch mit allen 20 Aminosäuren variiert wird (außer Serin/Threonin/Tyrosin an der festen Phospho-Akzeptorstelle).	Goldstandard Definiert das Konsensusmotiv der Kinase mit hoher Präzision. Quantifiziert den Beitrag jeder Aminosäure an jeder Position zur Substrataffinität.
Orientierte Peptidbibliotheken	Eine Bibliothek, die auf einer bekannten, suboptimalen Substratsequent basiert, wobei an bestimmten „orientierenden“ Positionen zufällige Reste eingeführt werden, um stärker bindende Varianten zu entdecken.	Verfeinerung bekannter Motive Ideal, um einen schwachen Treffer in ein hochaffines, spezifisches Substrat zu optimieren.
Proteom-abgeleitete Peptidbibliotheken	Eine Bibliothek von Peptiden, die direkt aus dem Proteom eines relevanten Organismus oder Gewebes stammen und natürliche Proteinsequenzen repräsentieren.	Entdeckung physiologischer Substrate Überbrückt die Lücke zwischen in vitro Motiv und in vivo Funktion. Am besten in Kombination mit Massenspektrometrie.
FRET-basierte Peptidbibliotheken	Peptide werden mit Fluorophor-Quencher-Paaren designt; Phosphorylierung stört die Interaktion und erzeugt ein detektierbares Signal.	Hochempfindliches HTS Ermöglicht direktes, kontinuierliches und hochdurchsatzfähiges kinetisches Screening von Tausenden Peptiden in Echtzeit.

Unser Workflow: Von der Bibliothek zum validierten Substrat

Service workflow for kinase substrate library construction

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Warum Creative Enzymes wählen

Fachspezifische Expertise

Tiefgehende Erfahrung in der Kinasebiologie gewährleistet ein rationales Design, das sich an bekannten Phosphorylierungsmotiven und katalytischen Präferenzen orientiert.

Anpassungsfähigkeit

Bibliotheken sind in Größe (von fokussierten Sets mit 20 Substraten bis zu großen Panels mit über 500), Motivabdeckung und Nachweismethode anpassbar.

Ausgewogene Abdeckung

Wir kombinieren Konsensusmotive mit Variantenpeptiden, um sowohl erwartete als auch neue Kinaseaktivitäten zu erfassen.

Assay-Kompatibilität

Substrate sind für Fluoreszenzpolarisation, FRET-basierte Assays, radiometrische Detektion oder LC-MS-Quantifizierung optimiert.

Qualität und Reproduzierbarkeit

Hochreine Peptide mit validierter Assay-Performance minimieren Variabilität und gewährleisten robustes Benchmarking.

Workflow-Integration

Unsere Bibliotheken integrieren sich nahtlos mit HTS und computergestützten Simulationen und schaffen eine durchgängige Pipeline von der Substratentdeckung bis zur Inhibitorauswahl.

Fallstudien und Erfolgsgeschichten

Fall 1: Profilierung einer neuartigen Tyrosinkinase für die Wirkstoffforschung

Kundenbedarf:

Ein Pharmaunternehmen, das eine neu identifizierte Tyrosinkinase untersuchte, benötigte eine Substratprofilierung, um einen Screening-Assay für die Inhibitorauswahl zu etablieren.

Unser Ansatz:

Wir entwarfen eine kundenspezifische Substratbibliothek aus 60 Tyrosin-haltigen Peptiden, basierend auf bekannten Motiven und vorhergesagten Konsensussequenzen. Das Screening erfolgte mit einem fluoreszenzbasierten Phosphorylierungsassay, gefolgt von einer Rangfolge der aktiven Substrate nach katalytischer Effizienz.

Ergebnis:

Die Analyse identifizierte drei Hochleistungssubstrate, die robuste Assaysignale lieferten. Diese Substrate wurden als Grundlage für die High-Throughput-Inhibitorauswahl des Kunden übernommen und beschleunigten dessen Lead-Identifizierung.

Fall 2: Charakterisierung der Serin/Threonin-Kinase-Spezifität in der akademischen Forschung

Kundenbedarf:

Eine akademische Arbeitsgruppe, die Stressantwortwege untersucht, wollte die Substratpräferenzen einer Serin/Threonin-Kinase mit bisher begrenzter Charakterisierung definieren.

Unser Ansatz:

Wir konstruierten eine Peptidbibliothek aus 40 Substraten mit unterschiedlichen Serin/Threonin-Motiven, darunter sowohl kanonische Konsensussequenzen als auch explorative Varianten. Das Screening erfolgte mittels LC-MS-Detektion zur Quantifizierung der Phosphorylierung.

Ergebnis:

Die Bibliothek zeigte eine klare Präferenz für Arginin an der –3-Position und hydrophobe Reste an +1. Diese Motiv-Analyse lieferte mechanistische Einblicke in die Rolle der Kinase bei der Stresssignalübertragung und wurde als Teil einer Peer-Review-Studie veröffentlicht.

FAQs zu unseren Kinase-Substratbibliotheks-Services

F: Können Sie Bibliotheken für Kinasen ohne bekannte Substrate entwerfen?

A: Ja. Wir nutzen Strukturmodellierung, Sequenzhomologie und Konsensusmotiv-Vorhersage, um rationale Peptidbibliotheken auch für wenig charakterisierte Kinasen zu entwerfen.
F: Welche Nachweismethoden sind mit Ihren Kinasebibliotheken kompatibel?

A: Unsere Bibliotheken sind assaybereit für fluoreszente, radiometrische, LC-MS- oder antikörperbasierte Nachweisformate – je nach Plattform des Kunden.
F: Wie groß kann eine Kinase-Substratbibliothek sein?

A: Bibliotheken können von kleinen explorativen Sets mit 20 Substraten bis zu umfassenden Panels mit mehreren hundert Peptiden reichen – je nach Projektumfang und Durchsatzanforderungen.
F: Liefern Sie Dokumentation zur Substratreinheit und -sequenz?

A: Ja. Jedes Peptid wird mit detaillierten Spezifikationen geliefert, einschließlich Sequenz, Synthesemethode, Reinheitsgrad und empfohlenen Lagerbedingungen.
F: Wie integrieren sich Ihre Bibliotheken in die nachgelagerte Inhibitorauswahl?

A: Identifizierte Hochleistungssubstrate können direkt für das High-Throughput-Inhibitor-Screening verwendet werden und ermöglichen so einen nahtlosen Übergang von der Substratentdeckung zur Wirkstoffentwicklung.
F: Wie lange dauert die Erstellung einer kundenspezifischen Kinase-Substratbibliothek?

A: Die Zeitpläne variieren je nach Bibliotheksgröße und Komplexität, aber typische Projekte werden innerhalb von 4–8 Wochen abgeschlossen; beschleunigte Optionen sind auf Anfrage verfügbar.

Referenz:

Manning BD, Cantley LC. Hitting the target: emerging technologies in the search for kinase substrates. Sci STKE. 2002;2002(162). doi:10.1126/stke.2002.162.pe49

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Projektbeschreibung:

Nur für Forschungs- und Industriezwecke. Nicht für den persönlichen Gebrauch bestimmt. Bestimmte Produkte in Lebensmittelqualität eignen sich für die Formulierungsentwicklung in Lebensmitteln und verwandten Anwendungen.

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