Klonen in Expressionsvektoren für zufällige Mutagenese und DNA-Shuffling

Anfrage

Erfolgreiche Enzymtechnik durch zufällige Mutagenese und DNA-Shuffling hängt nicht nur von der Erzeugung genetischer Vielfalt ab, sondern auch von der effizienten Expression dieser Varianten für funktionale Screenings. Bei Kreative Enzyme, unser Klonen in Expressionsvektoren Der Service stellt sicher, dass Ihre Genkonstrukte korrekt in geeignete Vektorsysteme eingefügt, orientiert und exprimiert werden – und legt somit eine solide Grundlage für die effektive Erstellung von Mutantenbibliotheken und nachfolgende Analysen.

Wir bieten umfassende Unterstützung beim Klonen, von der Vektorauswahl und dem Konstruktdesign bis hin zur Verifizierung und funktionalen Ausdruckstests. Ob Sie Wildtyp-Vorlagen für Mutagenese vorbereiten oder rekombinante Konstrukte für DNA-Shuffling zusammenstellen, Creative Enzymes sorgt für eine nahtlose Integration in optimierte Expressionssysteme.

Durch die Nutzung von präzisen Klonierungstechnologien, Codon-Optimierungsstrategien und einer breiten Palette von Vektorsystemen garantieren wir eine hoch effiziente Klonierung, reproduzierbare Expression und fehlerfreie Konstruktvalidierung, sodass jede entwickelte Variante sofort für den experimentellen Einsatz bereit ist.

Hintergrund: Genklonierung für zufällige Mutagenese

Zufällige Mutagenese und DNA-Shuffling sind leistungsstarke Techniken zur Erkundung des Sequenz-Funktionsraums und zur Generierung von Enzymvarianten mit verbesserten oder neuartigen Eigenschaften. Allerdings können selbst die ausgeklügeltsten Mutagenese- oder Rekombinationsexperimente scheitern, wenn die klonierten Konstrukte suboptimal sind.

Ein Expressionsvektor dient als funktionale Plattform für die Gen-Transkription und -Translation. Sein Design – einschließlich Promotorstärke, Ribosomenbindungsstelle, Tag-Konfiguration und Wirt-Kompatibilität – bestimmt direkt den Erfolg der Mutantenexpression und -screening. Fehler beim Klonen, Leserasterverschiebungen oder Vektorinkompatibilität können zu fehlgefalteten Proteinen, Bildung von Einschlusskörperchen oder vollständigem Verlust der Expression führen, was die Effizienz des nachgelagerten Screenings erheblich beeinträchtigt.

Um diese Fallstricke zu vermeiden, ist Sorgfalt erforderlich. Vektorauswahl, präzise Geninsertierung, und vollständige Überprüfung sind unverzichtbar. Bei Creative Enzymes kombinieren wir fortschrittliche molekularbiologische Expertise mit Hochdurchsatz-Klonierungstechniken, um validierte Expressionskonstrukte zu liefern, die für Mutagenese- und Shuffling-Workflows optimiert sind. Unser Service stellt sicher, dass jedes Gen oder rekombinante Konstrukt in das ideale Vektorsystem kloniert wird – bereit für fehleranfällige PCR, Rekombination, Expression oder Aktivitätsscreening.

Gene cloning service for random mutagenesis and DNA shuffling at Creative Enzymes

Was wir anbieten

Creative Enzymes bietet umfassende Klonierungsdienste, die auf Enzym-Engineering-Projekte mit zufälliger Mutagenese und DNA-Shuffling zugeschnitten sind. Unser Fachwissen umfasst Vektordesign, Klonierungsausführung und Konstruktverifizierung, um sicherzustellen, dass alle expressionsbereiten Plasmide zuverlässig und reproduzierbar sind.

Benutzerdefinierte Vektorenauswahl und -design

Wir helfen bei der Auswahl des optimalen Expressionsvektors basierend auf Enzymtyp, Wirtsystem und experimentellem Ziel. Zu den Optionen gehören bakterielle (z. B., E. coli pET, pBAD), Hefe (Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae), Insekten (Baculovirus) und Säugetiersysteme. Vektorelemente—Promotoren, Terminatoren, Tags und Selektionsmarker—sind auf Ihre Mutagenese- oder Shuffling-Strategie abgestimmt.

Präzise Geninsertions- und Konstruktzusammenstellung

Durch den Einsatz von hochpräzisen Klonierungstechniken wie Restriktions-/Ligation-Klonierung, Gibson-Assembly oder Gateway-Klonierung fügen wir Zielgene oder gemischte Fragmente mit präziser Kontrolle über Orientierung und Leserahmen ein. Bei Mehrgen-Konstrukten gewährleistet die modulare Montage die funktionale Expression aller Komponenten.

Subklonierung von synthetisierten oder vom Kunden bereitgestellten Genen

Egal, ob Ihre Gene von Creative Enzymes synthetisiert oder extern bereitgestellt werden, führen wir das Subklonieren in die gewählten Expressionsvektoren durch und gewährleisten dabei die Integrität der Sequenz und die Kompatibilität mit der nachgelagerten Bibliotheksgenerierung.

Klonen für zufällige Mutagenese-Vorlagen

Wir bereiten vektor-embedded Konstrukte vor, die für zufällige Mutagenese-Workflows optimiert sind, einschließlich fehleranfälliger PCR oder chemischer Mutagenese. Vektoren werden aufgrund ihrer robusten Amplifikation, hohen Kopienzahl und einfachen Screening ausgewählt.

Klonen für DNA-Shuffling-Konstrukte

Für DNA-Shuffling-Anwendungen stellen wir rekombinante Konstrukte zusammen, die den Austausch von Fragmenten, die Bildung von Rekombinationsjunctionen und die effiziente Erzeugung chimerischer Sequenzen erleichtern. Homologe Fragmente werden in kompatiblen Vektoren kloniert, um einen effizienten Crossover während des Shufflings zu gewährleisten.

Überprüfung und Validierung

Jede Konstruktion unterliegt einer vollständigen Sequenzverifizierungs- und Restriktionsverdauanalyse, um die Identität, Orientierung und Integrität des Inserts zu bestätigen. Detaillierte Berichte enthalten Vektorkarten, Chromatogramme und Annotationsdateien.

Service-Workflow

Workflow of vector cloning service for random mutagenesis and DNA shuffling

Dienstmerkmale

Klontechniken und -fähigkeiten

Restriktions-/Ligation-Klonierung: Traditionell, robust und ideal für standardisierte Plasmidsysteme.
Gibson-Versammlung & nahtloses Klonen: Hoch effizientes, sequenzunabhängiges Klonen für die Zusammenfügung mehrerer Fragmente.
Gateway- und Golden-Gate-Systeme: Modulare und kombinatorische Klonierung für Hochdurchsatzanwendungen.
TA- und TOPO-Klonierung: Schnelle Einfügung von PCR-amplifizierten Produkten ohne Restriktionsenzyme.
Rekombinationsbasierte Klonierung für DNA-Shuffling: Ermöglicht die schnelle Zusammenstellung homologer oder hybrider Fragmente mit hoher Genauigkeit.

Unterstützte Vektorsysteme

Bakteriell: pET, pBAD, pUC, pQE, pCold und maßgeschneiderte Konstrukte.
Hefe: pYES, pPICZ, pGAPZ, pRS und andere für Pichia pastoris oder S. cerevisiae.
Insekt: Baculovirus-Vektoren (pFastBac, pVL1393 usw.).
Säugetiere: pcDNA, pCMV und lentivirale Rückgrate für transiente oder stabile Expression.
Benutzerdefinierte Vektoren: Klonen in vom Kunden bereitgestellte oder proprietäre Vektoren.

Qualitätskontrollmaßnahmen

Überprüfung durch diagnostische Restriktionsverdauung.
Vollständige Sequenzierung von Einsätzen und flankierenden Regionen.
Bewertung der Plasmidreinheit (A260/A280 ≥ 1,8) und Konzentration.
Interne Kontrollen für Kloneffizienz und Reproduzierbarkeit.

Optionale Lieferungen

Ausdrucksvalidierung: Kleinmaßstäbliche Ausdruckstestung unter empfohlenen Bedingungen.
Funktionale Bestätigung: Optionale Enzymaktivitätsassays auf Anfrage des Kunden.
Archivierung und Dokumentation: Langzeitlagerung von Plasmiden und detaillierte digitale Aufzeichnungen für die Reproduzierbarkeit.

Ein Angebot anfordern

Warum Sie mit uns zusammenarbeiten sollten

Umfassende Vektor-Expertise

Umfangreiche Erfahrung in bakteriellen, Hefen-, Insekten- und Säugetiersystemen gewährleistet eine optimale Vektor-Wirt-Paarung für jedes Projekt.

Nahtlose Integration mit Mutagenese- und Shuffling-Workflows

Klonierte Konstrukte sind sofort mit unseren nachgelagerten Diversifizierungs- und Screening-Diensten kompatibel.

Hochpräzise Klontechnologien

Unsere fortschrittlichen Montageverfahren garantieren Genauigkeit und minimieren unerwünschte Mutationen oder Orientierungsfehler.

Vollständige Überprüfung und Qualitätsdokumentation

Jeder Plasmid ist vollständig verifiziert und wird mit detaillierten Berichten für eine vollständige Rückverfolgbarkeit geliefert.

Schnelle Umsetzung mit zuverlässigen Ergebnissen

Optimierte Arbeitsabläufe liefern fertige Konstrukte innerhalb von 10–15 Geschäftstagen, ohne die Qualität zu beeinträchtigen.

Engagierte wissenschaftliche Unterstützung und Vertraulichkeit

Personalisierte Beratung und Datenschutz gewährleisten, dass Ihre Forschung sicher und wissenschaftlich fundiert bleibt.

Vertretende Fallstudien

Fall 1: Klonierung einer Lipase-Genbibliothek in das pET-Expressionssystem

Kundenbedarf:

Ein Biokatalyseunternehmen plante, eine zufällige Mutantenbibliothek einer bakteriellen Lipase mithilfe von fehleranfälliger PCR zu erstellen. Ihr bestehendes Konstrukt wies jedoch kein geeignetes Expressionssignal auf, was zu unlöslicher Expression führte in E. coli.

Unser Ansatz:

Wir haben einen modifizierten pET-Vektor entworfen, der ein N-terminales His-Tag und eine optimierte Ribosomenbindungsstelle enthält. Das Lipase-Gen wurde mithilfe der Gibson-Assemblierung kloniert, und die Orientierung wurde durch Sequenzierung verifiziert.

Ergebnis:

Der neu klonierte Konstrukte ermöglichte die lösliche Expression und eine unkomplizierte Reinigung. Die anschließende Mutagenese erzeugte über 10.000 Varianten, von denen mehrere Mutanten eine 2,5-fach höhere Aktivität und verbesserte Thermostabilität aufwiesen. Das verifizierte Vektordesign wurde zum Standardtemplate des Kunden für zukünftige Ingenieurprojekte.

Fall 2: Rekombinante Klonierung für DNA-Mischung von Oxidoreduktasen

Kundenbedarf:

Ein Forschungskonsortium hatte zum Ziel, homologe Oxidoreduktasen aus verschiedenen Bakterienarten zu mischen, um die Cofaktor-Spezifität zu verbessern. Die Herausforderung bestand darin, homologe Fragmente in ein einzelnes Expressionsgerüst zu integrieren, ohne Sequenzfehlanpassungen einzuführen.

Unser Ansatz:

Wir führten klonierungsbasierte Rekombination unter Verwendung standardisierter Fragmentgrenzen durch. Jede homologe Sequenz wurde in einen Zwischenvektor subkloniert, verifiziert und dann mit einem nahtlosen Assemblierungssystem rekombiniert, um chimäre Konstrukte zu erzeugen.

Ergebnis:

Alle klonierten Hybriden wurden durch vollständige Sequenzierung bestätigt, die eine präzise Fragmentintegration zeigte. Die resultierenden Enzyme wiesen unterschiedliche Cofaktorpräferenzen auf, wobei eine Variante eine 3,8-fache Erhöhung der NADH-Spezifität zeigte. Das Projekt bestätigte die Wirksamkeit präziser Klonierungsstrategien für DNA-Shuffling-Workflows.

Fall 3: Hochdurchsatz-Klonierung von Esterase-Varianten für zufällige Mutagenese

Kundenbedarf:

Ein Hersteller von Industrieenzymen benötigte die parallele Klonierung von 96 Esterase-Varianten in Expressionsvektoren für ein Hochdurchsatz-Mutagenes Screening. Die manuelle Klonierung war ineffizient und fehleranfällig geworden.

Unser Ansatz:

Wir haben einen automatisierten Klonierungsworkflow unter Verwendung von Gateway-kompatiblen Vektoren implementiert. Jede Esterase-Variante wurde in einem parallelisierten Prozess in den Vektor eingefügt, was durch Kolonie-PCR und Sequenzierung verifiziert wurde.

Ergebnis:

Innerhalb von zwei Wochen erhielt der Kunde eine vollständig validierte Expressionsbibliothek, die bereit für die Mutagenese war. Der Erfolg des Projekts beschleunigte die Screening-Pipeline des Unternehmens, was zu mehreren verbesserten Varianten mit höherem Substratumsatz und verbesserter Lösungsmittelverträglichkeit führte.

Häufig gestellte Fragen

Q: In welche Arten von Vektoren können Sie klonen?

A: Wir unterstützen eine Vielzahl von bakteriellen, Hefen-, Insekten- und Säugetier-Expressionsvektoren. Auf Anfrage werden auch maßgeschneiderte oder proprietäre Vektoren akzeptiert.
Q: Kann man mehrere Gene in einen Vektor klonen?

A: Ja. Wir können modulare oder polycistronische Klonierung zur Ko-Expression mehrerer Gene durchführen, ideal für die Wege-Engineering oder Studien zu Multi-Domain-Enzymen.
F: Wie stellen Sie sicher, dass der klonierte Konstrukt korrekt ist?

Alle klonierten Konstrukte unterliegen einer diagnostischen Restriktionsverdauung, einer Kolonie-PCR und einer vollständigen Sequierungsüberprüfung der Verbindungsregionen, um die korrekte Orientierung und die Integrität der Sequenz zu bestätigen.
Bieten Sie Ausdruckstests nach dem Klonen an?

A: Ja, die optionale Validierung der Expression kann in Ihrem gewählten Wirtsystem durchgeführt werden, um die Proteinproduktion vor der zufälligen Mutagenese oder DNA-Shuffling zu bestätigen.
F: Können Sie mit meinem bereitgestellten Plasmid oder Vektor arbeiten?

A: Absolut. Wir können Subklonierung in vom Kunden bereitgestellten Vektoren durchführen oder diese anpassen, um die Kompatibilität mit Ihrem Arbeitsablauf zu optimieren.
F: Wie lange dauert der Klonungsprozess?

A: Die typische Bearbeitungszeit beträgt 10–15 Werktage, abhängig von der Komplexität des Konstrukts und dem Expressionswirt.
Q: Welche Informationen muss ich bereitstellen?

A: Bitte geben Sie die Zielgen-Sequenz, den gewünschten Vektor (oder Expressionssystem) sowie etwaige Klonierungsbeschränkungen oder -präferenzen an. Unser Team wird das Design und die Verifizierung übernehmen.
Q: Garantieren Sie Vertraulichkeit und den Schutz des geistigen Eigentums?

A: Ja. Alle Projektdaten, Plasmide und Sequenzen bleiben streng vertraulich, wobei die Kunden vollständige geistige Eigentumsrechte behalten.
Q: Können Sie expressionsbereite Glycerol-Stämme vorbereiten?

A: Ja. Wir können Glycerol-Stämme von verifizierten Klonen für die direkte Transformation oder die langfristige Lagerung liefern.
Q: Sind die klonierten Konstrukte mit nachgelagerten zufälligen Mutagenese- und Shuffling-Diensten kompatibel?

A: Ja. Alle Plasmide, die über diesen Service vorbereitet werden, sind vollständig kompatibel mit unseren zufälligen Mutagenese-, DNA-Shuffling- und Screening-Workflows.

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Nur für Forschungs- und Industriezwecke. Nicht für den persönlichen Gebrauch bestimmt. Bestimmte Produkte in Lebensmittelqualität eignen sich für die Formulierungsentwicklung in Lebensmitteln und verwandten Anwendungen.

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