Messung der Enzymaktivität der Pantetheinphosphat-Adenylyltransferase

Creative Enzymes präsentiert die neuesten Entwicklungen und Erkenntnisse im Bereich von Enzymaktivitätsassays. Durch das konsequente Streben nach Dienstleistungen höchster Qualität hat sich Creative Enzymes das Vertrauen von Tausenden von Kunden erworben. Wir sind auf hochgradig kundenspezifische und präzise bioanalytische Dienstleistungen spezialisiert. Im Folgenden stellen wir Ihnen gerne den zuverlässigsten enzymatischen Assay für Pantetheinphosphat-Adenylyltransferase zur Verfügung.

Coenzym A (CoA), der wichtigste Acylgruppen-Träger in allen lebenden Zellen, ist für zahlreiche Reaktionen des Intermediärstoffwechsels erforderlich. CoA spielt zudem eine entscheidende Rolle in zahlreichen biosynthetischen, abbauenden und energiegewinnenden Stoffwechselwegen. In einer lebenden Zelle wird CoA in fünf Schritten aus Pantothenat (Vitamin B₅), Cystein und ATP synthetisiert. Die Pantetheinphosphat-Adenylyltransferase (EC 2.7.7.3; PPAT) katalysiert den vorletzten Schritt dieses Biosynthesewegs, indem sie 4’-Phosphopantethein adenlyliert und dadurch Dephospho-CoA bildet. Eine nachfolgende Phosphorylierung an der 3’-Hydroxylgruppe des Riboserings durch die Dephospho-CoA-Kinase (EC 2.7.1.24) erzeugt den Acylgruppen-Träger CoA. Die Rate der CoA-Biosynthese wird durch Feedback-Inhibition des ersten Enzyms des Weges, der Pantothenat-Kinase (EC 2.7.1.33), reguliert. Untersuchungen der Zwischenprodukte der CoA-Biosynthese haben gezeigt, dass sowohl Pantothenat als auch 4’-Phosphopantethein in der Zelle akkumulieren können, was darauf hindeutet, dass PPAT möglicherweise einen zusätzlichen geschwindigkeitsbestimmenden Schritt im CoA-Biosyntheseweg katalysiert.

Abbildung 1: Biosynthese von CoA in E. coli.
Referenz: Miller J R, et al. Journal of Bacteriology, 2007, 189(22): 8196-8205.

PPAT ist ein Mitglied der Enzymfamilie der Nukleotidyltransferasen (α/β-Phosphodiesterasen), die eine Nukleotidmonophosphat-Einheit auf andere Substrate übertragen. Bakterielle PPATs sind allosterische Homohexamere. PPAT stellt ein attraktives antibakterielles Target dar, da es einen zentralen regulatorischen Schritt im CoA-Biosyntheseweg katalysiert und die humane PPAT im Vergleich zu ihren bakteriellen Gegenstücken deutlich unterschiedliche Strukturen aufweist.

Die Aktivität von PPAT kann spektrophotometrisch mittels eines gekoppelten Assays bestimmt werden. Beispielsweise wird die PPAT-Aktivität in der Rückwärtsrichtung unter Verwendung von Hexokinase und Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase bestimmt, um die ATP-Produktion mit der Reduktion von NADP+ zu koppeln. Der Assay wird bei Raumtemperatur durchgeführt, und die Änderung der Absorption bei 340 nm wird überwacht. Die Qualität unserer Ergebnisse wird durch den Einsatz modernster spektrophotometrischer Instrumentierung sichergestellt. Wir übertreffen unsere Wettbewerber durch kurze Durchlaufzeiten des Assays – sowohl bei einer Standard-Aktivitätsbestimmung als auch bei speziellen Anforderungen. Insgesamt ist Creative Enzymes Ihr vertrauenswürdiger Partner und freut sich darauf, auch Sie als Kunden zu gewinnen.

Abbildung 2: Die Kristallstruktur der Pantetheinphosphat-Adenylyltransferase aus E. coli.
PDB: 1H1T