Messung der Enzymaktivität der Thymidinphosphorylase mittels spektrophotometrischer Assays

Creative Enzymes ist ein industrielles Biotechnologieunternehmen, das auf Enzymaktivitätsassays spezialisiert ist. Wir sind fest davon überzeugt, dass die Qualität unserer Dienstleistungen die grundlegende Voraussetzung für unseren Unternehmenserfolg und die Basis unserer hohen Kundenzufriedenheit ist. Die professionellen Methoden und hochwertigen Services von Creative Enzymes unterstützen Kunden weltweit bei vielfältigen Aktivitätsassays für Transferasen, einschließlich der Thymidinphosphorylase.

Thymidinphosphorylase (EC 2.4.2.4; TP) ist ein einzigartiges Enzym der metabolischen Regulation, das die reversible Phosphorolyse von Thymidin, Desoxyuridin und deren Analoga zu den jeweiligen Basen und 2-Desoxyribose-1-phosphat katalysiert. Darüber hinaus katalysiert es den Desoxyribosyltransfer von einem Desoxynukleosid auf eine andere Base zur Bildung eines zweiten Nukleosids. Thymidinphosphorylase ist ein dimeres Enzym, das aus zwei identischen Untereinheiten besteht; die Molekülmasse jeder Untereinheit beträgt bei Säugetieren etwa 55.000 Dalton. Die humane Thymidinphosphorylase weist 39 % Sequenzidentität mit der Thymidinphosphorylase aus Escherichia coli auf, was zu einer ausgeprägten Sequenzhomologie führt.

Abbildung 1: Phosphorolyse-Reaktion von Thymidin mit Thymidinphosphorylase.
Referenz: Hatano A, et al. Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2008, 16(7):3866-70.

Der Mechanismus der Phosphorolyse-Reaktion wird als nukleophiler Prozess angesehen: Das ribosylische 1-anomere Kohlenstoffatom erfährt eine Addition eines Phosphat-Ions an seiner α-Seite. Es wurde berichtet, dass die Kristallstruktur der Thymidinphosphorylase im Komplex mit TPI (5-Chlor-6-[1-(2-iminopyrrolidinyl)methyl]uracil) HCl in einer aktiven Konformation vorliegt, was die Mechanismen anhand dieses inhibierten Komplexes weiter bestätigt.

Thymidinphosphorylase ist identisch mit dem plättchenabgeleiteten endothelialen Zellwachstumsfaktor (PD-ECGF), und die enzymatische Aktivität der Thymidinphosphorylase ist für die Angiogenese erforderlich. Somit ist Thymidinphosphorylase ein geeignetes Target für die Entwicklung antitumoraler Arzneimittel. Die Charakterisierung des katalytischen Verhaltens der Thymidinphosphorylase ist von grundlegender Bedeutung und stellt den ersten Schritt für das Design neuer antitumoraler Wirkstoffe dar.

Auf Basis der in den vergangenen Jahren durchgeführten Aktivitätsprüfungen zahlreicher Enzyme hat Creative Enzymes umfassende und fundierte Expertise aufgebaut und kann schnelle sowie qualitativ höchstwertige Assay-Services für Thymidinphosphorylase bereitstellen. Die enzymatische Aktivität der Thymidinphosphorylase kann bei 25 °C spektrophotometrisch bestimmt werden, indem kontinuierlich die Differenz der Absorption eines Nukleotids bei 290 nm gemessen wird. Mit modernster spektrophotometrischer Instrumentierung vollständig ausgestattet, gewährleisten wir die Zuverlässigkeit unserer Prüfungen.

Abbildung 2: Die Kristallstruktur der Thymidinphosphorylase aus E. coli.
PDB: 4EAF